【摘要】：糖(碳源)代謝過程是生物體最重要的代謝過程,其往往受到嚴(yán)格的信號調(diào)控。當(dāng)其代謝過程出現(xiàn)紊亂時,往往導(dǎo)致細胞不同程度的病變、死亡。釀酒酵母是研究較為深入的真核模式生物,具有食品級安全、代謝旺盛等特點,非常適合作為多種發(fā)酵產(chǎn)品生產(chǎn)的細胞工廠,深入研究其代謝調(diào)控機制將有助于開發(fā)新的構(gòu)建策略,促進其在代謝工程、合成生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。釀酒酵母糖代謝和大部分真核生物一樣,主要包括糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑、TCA循環(huán)、乙醛酸循環(huán)和糖異生途徑等;另一方面,其代謝又具有典型的特點。當(dāng)生長環(huán)境中存在豐富發(fā)酵性碳源(最典型的:葡萄糖)的條件下,無論供氧充足與否,釀酒酵母細胞都處于強酵解狀態(tài),只有少量丙酮酸進入TCA循環(huán)進行呼吸代謝,而大部分生成乙醇。當(dāng)葡萄糖耗盡,酵母通過級聯(lián)的信號途徑做出響應(yīng),從轉(zhuǎn)錄、翻譯、翻譯后蛋白質(zhì)修飾等各個層面調(diào)節(jié)各大代謝途徑中基因的表達和蛋白活性,從而精確調(diào)控代謝網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)為呼吸代謝模式,利用發(fā)酵葡萄糖時積累的非發(fā)酵性碳源——乙醇進行二次生長。這種碳源切換引起的蛋白表達修飾和生理代謝變化過程涉及生命活動最基本的對環(huán)境營養(yǎng)的響應(yīng)和對自身代謝的調(diào)控,而被科學(xué)家們長期關(guān)注。目前對這些過程涉及的信號系統(tǒng)以及調(diào)節(jié)機制主要包括對細胞整體代謝酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和蛋白磷酸化修飾以及相關(guān)的調(diào)控通路和反饋回路,仍然處于有限認知的水平。賴氨酸乙�；羌毎麅�(nèi)一種重要的翻譯后修飾過程。多年來,相關(guān)研究主要集中在組蛋白乙酰化修飾對基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)、DNA的復(fù)制和修復(fù)等,關(guān)注的是主要是其表觀遺傳學(xué)意義,也有少部分工作涉及到了代謝等生理特征等表型現(xiàn)象。另一方面,最近的研究發(fā)現(xiàn),除組蛋白外,大量代謝酶蛋白也存在乙酰化位點�；诖�,本論文從代謝酶在不同碳源條件下的乙�；町惡蛿_動乙酰化和脫乙�；^程對碳代謝的影響兩個角度,初探在調(diào)控水平乙�；瘜︶劸平湍柑即x的影響。本論文第一部分工作首先利用高分辨質(zhì)譜解析發(fā)酵性碳源葡萄糖以及非發(fā)酵性碳源乙醇這兩種碳源條件下釀酒酵母乙�；M的差異。結(jié)果顯示,在乙醇條件下,糖酵解途徑、戊糖磷酸途徑、核糖體蛋白的乙�；蕉喑尸F(xiàn)下調(diào)趨勢:三羧酸循環(huán)中蛋白乙酰化水平呈現(xiàn)上調(diào)趨勢。之后,選擇在不同碳源條件下存在乙�；町惖拇x途徑蛋白和糖信號途徑蛋白,利用點突變技術(shù),將乙酰化位點處賴氨酸突變?yōu)榫彼?使該乙�；稽c成為組成型非乙�；癄顟B(tài)。繼而,通過生化水平的酶學(xué)測定,研究具體的乙�；揎椢稽c對蛋白活性的影響。結(jié)果顯示,分別與對照相比,丙酮酸激酶(編碼基因PYK1)、蘋果酸脫氫酶(編碼基因MDH1)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(編碼基因ZWF1)乙�；稽c突變菌株比酶活分別提高了25.6%、41.4%、27.3%;而果糖1,6-二磷酸醛縮酶(編碼基因FBA1)乙�；稽c突變菌株比酶活降低了 19.9%。上述代謝酶單個酶活性水平的變化不影響菌株的發(fā)酵特征。但是,乙醇脫氫酶(編碼基因ADH1)乙�；稽c突變后,菌株發(fā)酵葡萄糖時菌體得率明顯降低,而乙醇得率增加,乙酸明顯積累。這些結(jié)果表明,釀酒酵母中,乙酰化會影響代謝酶活性,某些酶如Adh1突變子能夠顯著影響代謝。多個酶蛋白乙�；町悗淼恼w調(diào)控效應(yīng)還有待進一步論證。課題第二部分通過敲除乙�；富蛉ヒ阴；傅拇呋瘉喕蛑匾M成亞基,人為擾動乙酰化過程并研究了這些擾動對菌株代謝特征的影響。結(jié)果顯示,敲除GCN5、ADA2對菌體得率沒有影響,對葡萄糖利用沒有促進作用,乙醇得率略有增加;敲除NAT3降低了菌體得率,對葡萄糖利用沒有促進作用,乙醇得率略有增加;敲除HOS2、HST2、SET3、RCO1、SDS3、RPD3沒有對葡萄糖的利用和乙醇產(chǎn)生沒有明顯影響。敲除ARD1、SAS3加快了發(fā)酵代謝階段葡萄糖的利用,降低菌體得率,增加乙醇得率;敲除HAT1(目前酵母中唯一已知的細胞質(zhì)乙�；D(zhuǎn)移酶)能夠加快呼吸代謝階段乙醇的利用。這些結(jié)果表明,乙酰化參與釀酒酵母的細胞代謝調(diào)控,但具體機制還有待進一步研究�，F(xiàn)有的代謝組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、磷酸化組等研究對釀酒酵母碳代謝的揭示已經(jīng)相對比較深入,但有關(guān)代謝的調(diào)節(jié)機制仍有很多未知。近年來,有觀點認為乙�；{(diào)節(jié)細胞生理代謝具有從細菌到人類的保守性。本論文的研究是有關(guān)蛋白乙�；{(diào)節(jié)代謝研究的有益補充,具有揭示生物界代謝機制和支持進化觀點的廣泛意義。
【圖文】：

邐山東大學(xué)碩士學(xué)位論文發(fā)酵性碳源時（圖Ｍ），低葡萄糖水平激活Ｓｎｆｌ激酶，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的磷酸化和失活，允許基因表達。Ｃａｔ８，邋Ｓｉｐ４和Ｒｄｓ２也是Ｓｎｆｌ和Ｇｓｍ］（可能）是似的激活劑，其基因產(chǎn)物是參與Ｃａｔ８和合物的一部分。ＣｄｒＳ的表達可能是自動調(diào)節(jié)的。ＣａｔＳ和可能性Ｓｉｐ４的正調(diào)節(jié)劑。Ｃａｔ８，邋Ｓｉｐ４，邋Ｒｄｓ２，邋Ｅｒｔｌ和Ｇｓｍ丨都是編碼關(guān)鍵糖的轉(zhuǎn)錄激活因子。ＣＨＩＰ分析表明，Ｒｄｓ２結(jié)合到ＯＰ／ｉ基因，其謝的ＧＬＴ／和ＧＬＴ２表達的阻遏物（Ｔｕｒｃｏｔｔｅ邋ｅｔ邋ａＬ邋２０１０）。這些調(diào)交疊．．，形成復(fù)雜、精確的調(diào)控回路（Ｂｒｏａｃｈ，邋２０１２；邋Ｆｅｍａｎｄｅｚ－ＧａｒＫｕｔｔｙｋｒｉｓｈｎａｎ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１０）。逡逑Ｓｎｆ１逡逑ｋｉｎａｓｅ邋ａｃｔｉｖｅ

人類癌細胞系中鑒定出驚人的１．７５０種乙�；鞍踪|(zhì)（Ｃｈｏｕｄｈａｒｙ邋ｅｔ邋ａＬ邋２００９）。乙逡逑酰化蛋白質(zhì)在小鼠和人肝臟中高度保守（Ｚｈａｏ邋ｅｔ邋ａＬ邋２０１０）．但在肝臟和白血病細逡逑胞之間有很大不同（圖１－３）。幾乎所有參與糖酵解，ＴＣＡ循環(huán)，尿素循環(huán)，脂逡逑肪酸l#化和氮代謝的酶都可能被乙�；４x酶的活性受二個主要水平控制：酶逡逑的量，催化活性和底物的可接近性�？赡尜嚢彼嵋阴；鳛榇x中的主耍調(diào)節(jié)機逡逑制出現(xiàn)，其涉及控制代謝酶的所有Ｆ個水平并乜在人類疾病中經(jīng)常改變。因此，，逡逑無論在修飾的底物數(shù)量上看，還足從其促進的各種調(diào)節(jié)機制上Ｃ％乙�；c細胞逡逑調(diào)節(jié)中的其他常見翻譯后修飾…樣重要（Ｘｉｏｎｇ邋＆邋Ｇｕａｎ．邋２０１２）。逡逑癌細胞通過調(diào)節(jié)代謝酶的轉(zhuǎn)錄或翻譯后修飾（ＰＴＭ）來實現(xiàn)代謝重編程逡逑（ＶａｎｄｅｒＨｅｉｄｅｎｅｔａｌ．．邋２００９），例如，丙酮酸激酶（ＰＫ）催化糖酵解的最后一步，逡逑６逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q936

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