【摘要】：線粒體作為一種具有雙層膜結(jié)構(gòu)且能獨立復(fù)制的細(xì)胞器,是細(xì)胞內(nèi)合成ATP的主要場所。在粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe,S.pombe)中,線粒體基因組(mtDNA)的表達(dá)對線粒體功能的發(fā)揮至關(guān)重要。mtDNA主要編碼氧化磷酸化復(fù)合物的7個關(guān)鍵亞基,線粒體蛋白合成所需要的兩個核糖體亞基和25種tRNA以及RNase P的RNA亞基(rnpB)。PPR蛋白含有2-30個PPR模體,該結(jié)構(gòu)由簡并的35個串聯(lián)重復(fù)的氨基酸組成,可與RNA結(jié)合。在人和小鼠、植物和芽殖酵母等物種中,PPR蛋白參與了mtDNA編碼的基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。PPR蛋白與RNA特異結(jié)合,與RNA5′端成熟、內(nèi)含子剪切、RNA編輯和穩(wěn)定等密切相關(guān)。我們實驗室報道Ppr10可以免疫共沉淀出Mpa1,以及Ppr10和Mpa1參與了線粒體蛋白質(zhì)的翻譯。但是不清楚Ppr10和Mpa1形成復(fù)合體的生理意義。本文針對上述問題開展了研究。首先利用雙分子熒光互補(bǔ)(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)方法檢測Ppr10和Mpa1在活細(xì)胞內(nèi)的相互作用,Western blotting和熒光顯微鏡觀察實驗結(jié)果表明Ppr10與Mpa1在體內(nèi)存在直接相互作用。另一方面,體外研究Ppr10和Mpa1相互作用的意義的關(guān)鍵是獲得Ppr10-Mpa1復(fù)合體和Ppr10。本文利用粟酒裂殖酵母ESP~?表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了Ppr10-Mpa1復(fù)合體和Ppr10。為得到Ppr10-Mpa1復(fù)合體,利用ESP~?表達(dá)系統(tǒng)將ppr10和mpa1克隆到pESP2質(zhì)粒上,實現(xiàn)蛋白Ppr10和Mpa1在粟酒裂殖酵母中共表達(dá)。利用FastPrep-24儀器和GST親和層析柱純化得到Ppr10-Mpa1復(fù)合體,復(fù)合體基本達(dá)到體外研究對于蛋白純度的要求。作為對照實驗,利用同樣的方法在粟酒裂殖酵母中表達(dá)Ppr10并純化GST-Ppr10。本文研究為后續(xù)體外研究Ppr10和Mpa1相互作用的生理意義,如利用熒光熱穩(wěn)定性方法檢測Mpa1是否促進(jìn)Ppr10的穩(wěn)定性打下了基礎(chǔ)。粟酒裂殖酵母Atp4被預(yù)測為線粒體ATP合酶F0的組成蛋白,但是具體功能并不清楚。本文通過表型研究發(fā)現(xiàn)atp4敲除后菌株出現(xiàn)生長缺陷,熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)atp4定位于線粒體內(nèi)。Atp4的缺失導(dǎo)致線粒體基因組編碼的蛋白Cob1、Cox1、Cox2和Atp6表達(dá)水平急劇下降。以上研究說明atp4對線粒體蛋白表達(dá)量的穩(wěn)定很重要。
【圖文】：

線粒體（mitochondria）是由內(nèi)外兩層平行的單位膜形成的封閉囊狀結(jié)構(gòu)。外膜起邊界的作用，而內(nèi)膜向內(nèi)折疊成嵴。外膜和內(nèi)膜將線粒體分隔形成膜間隙和線粒體基質(zhì)。ATP、NAD 和輔酶 A 等自由通過外膜，使得膜間隙中的成分與胞質(zhì)溶液相似。內(nèi)膜富含心磷脂具有高度不透性，對于建立質(zhì)子電化學(xué)梯度從而驅(qū)動 ATP 的合成具有重要意義�；|(zhì)內(nèi)含有大量與三羧酸循環(huán)（TCA）、脂肪酸氧化、氨基酸降解等有關(guān)的酶，同時與 DNA 復(fù)制和 RNA 合成相關(guān)。線粒體被組織成管狀網(wǎng)絡(luò)，其形態(tài)由分裂和融合控制，使其形態(tài)適應(yīng)細(xì)胞的代謝需求[1]。線粒體間通過融合而相互連接，而通過分裂形成許多線粒體片段。在整個線粒體網(wǎng)絡(luò)中通過分裂和融合充分地混合酶、代謝物和線粒體基因產(chǎn)物，相互連接的線粒體有益于活細(xì)胞的呼吸[2]。線粒體被認(rèn)為是真核細(xì)胞的發(fā)源地，是三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化的宿主。三羧酸循環(huán)是經(jīng)過酶促反應(yīng)再生成檸檬酸的過程，過程中產(chǎn)生的乙酰輔酶 A 與糖類、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝相聯(lián)系。乙酰輔酶 A 進(jìn)入 TCA 被氧化產(chǎn)生還原劑 NADH 和 FADH。NADH 和 FADH 將電子轉(zhuǎn)移至線粒體呼吸鏈作為氧化磷酸化的電子供體。

點在雙鏈上同時啟動轉(zhuǎn)錄，，最終產(chǎn)生兩條多順反子，主要是分布在 mRNA 和 rRNA 之間的 tRNA 序列[18]達(dá)調(diào)控可以發(fā)生在多個方面，如線粒體基因組的拷、翻譯及呼吸鏈亞基的穩(wěn)定性。其中，線粒體翻譯（Pentatricopeptide repeat，PPR）蛋白是由 2-30 個串并的 35 個氨基酸。PPR 模體主要與序列特異性的 殖酵母（Saccharomyces cerevisiae, S. cerevisiae）PP成復(fù)合體并與 COX1 的 mRNA 結(jié)合[17]。PPR 蛋白的列中的第 4 和 34 位氨基酸位置所決定的[22]。晶體結(jié)疊形成以一個環(huán)進(jìn)行連接的一對反向平行的α-螺旋
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q78

【參考文獻(xiàn)】

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1 李璞媛;白文濤;張芳琳;吳興安;胡剛;劉艷麗;王海濤;張偉;徐志凱;;漢坦病毒囊膜糖蛋白G2在畢赤酵母GS115中的表達(dá)及鑒定[J];科學(xué)技術(shù)與工程;2007年08期

2 吳朝霞,鄭文嶺,馬文麗;裂殖酵母作為外源基因表達(dá)系統(tǒng)[J];生命科學(xué)研究;2004年S1期

本文編號：2636977