【摘要】：高鹽腌制食品中產(chǎn)生的亞硝酸鹽具有潛在的致毒、致癌和致畸性。降解亞硝酸鹽最常用和最有效的方法是生物法。為了消除腌制食品中亞硝酸鹽的危害,本研究選擇分布于天然高鹽環(huán)境的嗜鹽古菌為研究對象,篩選降解亞硝酸鹽的菌株,進(jìn)而開展嗜鹽古菌亞硝酸鹽還原酶的異源表達(dá)與功能研究,希望為嗜鹽古菌亞硝酸鹽還原酶在腌制食品加工中的應(yīng)用提供依據(jù)。對我國不同地區(qū)的32個高鹽環(huán)境樣品進(jìn)行高通量測序分析,旨在闡明我國主要鹽環(huán)境嗜鹽古菌的分布格局。結(jié)果顯示,沿海與內(nèi)陸、東北與西北鹽環(huán)境的古菌群落構(gòu)成差異較大。絕大部分沿海地區(qū)的樣品是以嗜鹽古菌為優(yōu)勢類群,且豐度高、嗜鹽古菌群落組成差異大。選擇嗜鹽古菌為優(yōu)勢類群的新疆六團鹽堿地(LT)、山西運城鹽池(YCN)、海南鶯歌海鹽場(YGH)、福建漳浦鹽田(ZP)、連云港臺南鹽田(TNN)等環(huán)境樣品進(jìn)行可培養(yǎng)研究,獲得的88株嗜鹽古菌中Halomicrobium與Haloarcula屬的菌株降解亞硝酸鹽的能力最強。選擇降解率為100%的菌株YCN54和ZP60進(jìn)行全基因組測序,分別注釋出編碼亞硝酸鹽還原酶的基因nirK_(Hrs)與nirK_(Hmc)。nirK_(Hrs)編碼區(qū)全長1071 bp,編碼356個氨基酸殘基;nirK_(Hmc)全長1095 bp,編碼364個氨基酸殘基。經(jīng)結(jié)構(gòu)域、信號肽及高級結(jié)構(gòu)預(yù)測,表明NirK_(Hrs)與NirK_(Hmc)是含有Cu-nitrite-reductase超家族結(jié)構(gòu)域與信號肽的銅型亞硝酸鹽還原酶,且是同三聚體蛋白。通過嗜鹽古菌異源表達(dá)體系分別表達(dá)了NirK_(Hrs)與NirK_(Hmc),經(jīng)Ni~(2+)柱親和層析獲得了有活性的重組亞硝酸鹽還原酶,選擇活性更高的重組亞硝酸鹽還原酶NirK_(Hrs)進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)表征。再經(jīng)過Superdex 200凝膠過濾層析,NirK_(Hrs)的SDS-PAGE結(jié)果表明蛋白的表觀分子量約為42與48 kDa,且質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明所得蛋白即目的蛋白。經(jīng)全波長掃描可知,NirK_(Hrs)是藍(lán)色的銅型亞硝酸鹽還原酶。該酶的最適反應(yīng)溫度為55?C,最適pH為7.0,最適NaCl濃度為4.5 M,且在30、50、70?C下具有良好的熱穩(wěn)定性。對甘油、DMSO、DMF、異丙醇、吐溫20、吐溫80、10%SDS等有機試劑具有良好的耐受性。食品添加劑——連二亞硫酸鈉(Na_2S_2O_4)可以作為有效的電子供體用于亞硝酸鹽還原酶的應(yīng)用中。本研究獲得的重組亞硝酸鹽還原酶NirK_(Hrs)與已報道嗜鹽古菌亞硝酸鹽還原酶在性質(zhì)上具有較大差異,且其最顯著的耐鹽特性為在高鹽腌制食品加工中的應(yīng)用提供依據(jù)。
【圖文】：

17圖 2.1 采樣點的地理分布情況Fig. 2.1 Geographical distribution of sampling points2.3.2 高通量測序文庫評價（1）稀釋性曲線根據(jù)古菌高通量測序文庫的稀釋性曲線（圖2.2），當(dāng)隨機抽取的序列達(dá)到3500條時，雖然仍有新的OTU被發(fā)現(xiàn)，但是曲線整體趨于平緩，說明更深的測序幾乎不會產(chǎn)生更多的OTU，因此該文庫的測序結(jié)果能夠基本代表樣品古菌群落的組成，可以用于后續(xù)的生物信息學(xué)分析。

2.3.2 高通量測序文庫評價（1）稀釋性曲線根據(jù)古菌高通量測序文庫的稀釋性曲線（圖2.2），當(dāng)隨機抽取的序列達(dá)到3500條時，雖然仍有新的OTU被發(fā)現(xiàn)，但是曲線整體趨于平緩，說明更深的測序幾乎不會產(chǎn)生更多的OTU，，因此該文庫的測序結(jié)果能夠基本代表樣品古菌群落的組成，可以用于后續(xù)的生物信息學(xué)分析。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TS201.3

【參考文獻(xiàn)】

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2 夏s

本文編號：2634334