【摘要】：小桐子是一種具有巨大開發(fā)潛力的能源植物樹種,低溫是影響小桐子存活和生長的主要限制因子。我們實驗室前期研究表明低溫鍛煉顯著提高小桐子的抗冷性。已知miRNAs在植物對逆境脅迫響應與適應中起重要作用,但miRNAs如何調控小桐子抗冷性尚未見到報道。弄清小桐子低溫鍛煉過程中miRNAs參與抗冷性提高的分子機制,獲取與抗冷性密切相關的關鍵miRNAs及其靶基因,有助于我們更好理解小桐子抗冷性形成的分子機制。本研究首先進行了小桐子低溫脅迫下microRNAs實時熒光定量PCR內參的篩選與比較,而后分析了低溫鍛煉誘導小桐子抗冷性形成過程中一些重要的miRNAs基因及其對應的靶基因表達的變化,為揭示miRNAs參與小桐子低溫鍛煉下抗冷性形成的分子機制提供了一定的理論和實驗基礎。研究結果如下:1.基于以前的小RNA-seq結果,以低溫處理的小桐子為材料,挑選11個候選內參基因,用實時熒光定量PCR技術檢測它們在不同樣本中的表達量,采用GeNorm、NormFinder和BestKeeper軟件進行表達穩(wěn)定性綜合分析。結果表明,表達最穩(wěn)定的基因是miR6448和U6,miR6448的Ct值為23左右,表達豐度適中;U6的Ct值為10左右,表達豐度高;因此,miR6448可作為小桐子低溫脅迫下表達豐度適中的miRNAs qRT-PCR的內參基因;U6可作為小桐子低溫脅迫下豐度較高的miRNAs qRT-PCR的內參基因。2.通過熒光定量PCR檢測小桐子低溫脅迫下的32個差異表達的候選miRNAs,發(fā)現(xiàn)除miR5284、miR5494、miR6189外,其它miRNAs的表達趨勢與小RNA-seq的結果一致;檢測結果表明:在低溫脅迫處理期間經(jīng)過鍛煉小桐子幼苗中22個miRNAs的表達量高于未經(jīng)過鍛煉的;經(jīng)過鍛煉的小桐子幼苗中8個miRNAs的表達量低于未經(jīng)過鍛煉的;2個miRNAs的表達量在經(jīng)過鍛煉與未經(jīng)鍛煉的小桐子幼苗中無顯著性差異。qRT-PCR的結果為低溫鍛煉誘導小桐子抗冷性形成過程中一些重要的miRNA的進一步研究提供一定的實驗基礎。3.通過對32個有差異表達的miRNAs進行的生物信息學分析,對其靶基因預測進行了GO富集、KEGG富集和功能歸類。GO富集分析,參與脂質代謝過程的靶基因有10個,有84個基因參與蛋白質去磷酸化、信號轉導和代謝過程等生物學過程;KEGG富集共獲得212條pathway通路,參與植物激素信號傳導的靶基因有12個,參與RNA轉運的靶基因有12個,參與脂肪酸代謝的靶基因有9個,參與磷脂酶的有5個靶基因;對預測到的靶基因進行功能歸類,大致分為:轉錄因子、蛋白激酶、磷酸酶、合酶、合成酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、還原酶、水解酶、磷脂酶、脫飽和酶。采用熒光定量PCR對小桐子低溫脅迫下6個候選miRNA及其響應的與膜脂密切相關的靶基因,進行miRNA-mRNA表達模式分析,結果表明:miR5254對靶基因PLC起到負調控作用;miR5284對靶基因FAD6起到負調控作用;miR6189對靶基因FAR起到正調控作用;miR165、miR4239對靶基因PLA起到負調控作用;miR5827對靶基因FAD3起到負調控作用。4.從鑒定到的6個與低溫脅迫下受miRNA調控的與膜脂密切相關的靶基因中,選取2個表達量高且變化倍數(shù)顯著的基因(FAD3和FAD6),進行基因克隆、生物信息學分析及預測蛋白結構,為后續(xù)使用基因工程手段改良小桐子抗冷性提供了理論和實驗基礎。
【圖文】：

第 1 章 研究背景效地提高其抗冷能力，這在玉米、茄子、番茄、棉花和煙草上均表現(xiàn)為經(jīng)過低溫鍛煉的的植株較未經(jīng)過低溫馴化的植株有更好的增長趨勢[38-39]。我們實驗室前人的研究證實小桐子幼苗經(jīng)過 12 ℃低溫鍛煉，與未經(jīng)過低溫鍛煉相比，在 1 ℃低溫脅迫下，低溫鍛煉能顯著提高低溫脅迫下小桐子幼苗葉片和莖中抗氧化酶如氧化物酶、過氧化氫酶、愈創(chuàng)木酚過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶、超氧化物歧化酶、脫氫抗壞血酸還原酶與單脫氫抗壞血酸還原酶等的活性，提高抗壞血酸和還原型谷胱甘肽的含量，且通過抗氧化酶和抗氧化劑的協(xié)同作用，降低小桐子幼苗中丙二醛含量的積累和電解質的滲漏，減緩由于低溫脅迫而導致的活性氧損傷和膜損傷，抑制甜菜堿醛脫氫酶、Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶、鳥氨酸轉氨酶的活性，最終誘導幼苗葉片和莖中的滲透調節(jié)物質，如甜菜堿、脯氨酸、可溶性糖等的積累生物合成，在低溫脅迫過程中降低小桐子幼苗葉片的滲透勢和水勢，提高小桐子幼苗對低溫脅迫的抵抗能力[14-15]；研究表明，以冷敏植物臨界生長溫度12 ℃對小桐子幼苗進行低溫鍛煉能顯著提高低溫脅迫下小桐子的抗冷性，且研究表明 12 ℃低溫鍛煉 2d 的效果最佳，可明顯提高小桐子抗冷性[14-15]（圖 1.1）。AB

第 1 章 研究背景個突出核苷酸[54]。隨后，DCL1 酶在核酸 CAP 結合復合體(CBC)的輔助下e-miRNA 切割成 miRNA::miRNA*二聚體雙鏈結構。miRNA::miRNA*復合甲基化轉移酶（HENI）識別，雙鏈復合體中兩條鏈 3'末端的 2'核糖羥基發(fā)基化，提高復合體的穩(wěn)定性[55]。甲基化后 miRNA::miRNA*雙鏈復合體在植內的 HST(HASTY)蛋白幫助下轉運到細胞質中，miRNA::miRNA*雙鏈復合過細胞質中的解旋酶作的用形成成熟的單鏈miRNA和miRNA*序列，miRN在 miRNA 加工成熟過程中與其互補的大約 22 個核苷酸的 RNA 序列；最熟的單鏈 miRNA 與 AGO(Argonaute)等蛋白形成 RNA 誘導的沉默復合NA-Induced Silencing Complex，RISC)，對靶基因行使調控的功能，而單鏈iRAN*則在體內被降解[56-57]。
【學位授予單位】：云南師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q945.78

【參考文獻】

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本文編號：2634289