【摘要】：蛋白質(zhì)作為生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ),在生物體內(nèi)發(fā)揮著非常重要的作用。其中,蛋白質(zhì)上存在多種翻譯后修飾(PTMs),如磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化等,這些修飾調(diào)控著蛋白的結(jié)構(gòu)并可以顯著改變蛋白的生理功能。其中泛素作為一種由76個(gè)氨基酸組成的小分子蛋白,與其它的翻譯后修飾不同,它的作用方式更加復(fù)雜,并幾乎參與細(xì)胞生命周期的各個(gè)方面,如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)降解、細(xì)胞凋亡、DNA損傷修復(fù)等生理過(guò)程。泛素化的過(guò)程是通過(guò)由E1激活酶(Els),E2結(jié)合酶(E2s)和E3連接酶(E3s)組成的酶聯(lián)級(jí)反應(yīng)進(jìn)行的。人體大約有600多個(gè)E3酶,根據(jù)它們存在的特征區(qū)域與催化轉(zhuǎn)移的機(jī)制分成不同家族:RING(Really Interesting New Gene),HECT(homologous to the E6AP carboxyl terminus)和RBR(RING-between RING-RING)。泛素化過(guò)程也可以由不同的去泛素化酶(DUB)進(jìn)行逆向調(diào)控。這些酶的活性在體內(nèi)受到嚴(yán)格監(jiān)管,一旦發(fā)生遺傳改變、異常表達(dá)或者功能障礙通常會(huì)導(dǎo)致一些病理性疾病,譬如E3連接酶Parkin的突變?cè)斐稍绨l(fā)型的常染色體隱性遺傳性;DUB中USP28在結(jié)腸和乳腺腫瘤中過(guò)表達(dá)。由于泛素自身含有七個(gè)不同位點(diǎn)的賴氨酸(K6,K11,K27,K29,K33,K48,K63)以及N端甲硫氨酸(Met)裸露的氨基(M1),導(dǎo)致泛素自身形成不同長(zhǎng)度的單一鏈型的泛素鏈和多個(gè)鏈型的混合、分支泛素鏈。而這些不同鏈長(zhǎng)及鏈連接類(lèi)型直接導(dǎo)致了不同泛素鏈之間具有較大生理功能差異。為了對(duì)泛素相關(guān)的復(fù)雜體系進(jìn)行探索,目前有三方面研究正蓬勃開(kāi)展:1.運(yùn)用均一的泛素鏈樣品開(kāi)展泛素相關(guān)的生物化學(xué)、生物物理以及結(jié)構(gòu)生物學(xué)探索,以揭示不同鏈型的泛素鏈調(diào)控修飾蛋白的生物化學(xué)機(jī)制。2.發(fā)展泛素相關(guān)活性探針對(duì)不同細(xì)胞環(huán)境中的多種酶活性進(jìn)行監(jiān)測(cè)并研究它們?cè)诎┌Y發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制。3.發(fā)展泛素?zé)晒庠噭⿲?duì)泛素相關(guān)酶的活性進(jìn)行直接和定量檢測(cè),并用于相關(guān)抑制劑的篩查。針對(duì)以上三方面本文開(kāi)展了研究工作,主要包括:第一部分工作中,我們發(fā)展了一種實(shí)用的方法,將輔基修飾的泛素單體作為連接單元構(gòu)建泛素鏈。該策略的優(yōu)點(diǎn)是所有的單體原料可通過(guò)細(xì)菌重組表達(dá)的方式容易的獲取,這允許泛素單元的同位素標(biāo)記并用于NMR的結(jié)構(gòu)分析。使用該泛素單元通過(guò)輔基介導(dǎo)的自然化學(xué)連接(NCL)策略我們合成了多種泛素鏈,不僅制備了單一鏈型的K48和K6連接的三泛素,還制備了由K48,K6組成的混合鏈型的三泛素。DUB水解實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了它們良好的生物活性。我們預(yù)計(jì)該方法可進(jìn)一步拓展到泛素化蛋白的合成中,為泛素相關(guān)生物化學(xué)和生物物理研究奠定基礎(chǔ)。第二部分工作中,我們發(fā)展了一種簡(jiǎn)易的基于酰肼的NCL及連續(xù)脫氫丙氨酸(Dha)形成的策略制備E2-Ub-Dha探針。制備該探針的操作簡(jiǎn)單,并且所用材料均已商業(yè)化,所以該策略可在普通實(shí)驗(yàn)室中實(shí)施。運(yùn)用E2-Ub-Dha探針我們不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)體外表達(dá)的HECT E3酶的有效標(biāo)記,而且對(duì)復(fù)雜細(xì)胞裂解液環(huán)境中的HECT E3酶也可進(jìn)行標(biāo)記。該探針的開(kāi)發(fā)將有助于我們理解HECT E3酶在不同細(xì)胞環(huán)境中的作用和功能,并可進(jìn)一步促進(jìn)相關(guān)抑制劑的研發(fā)。第三部分工作中,我們發(fā)展了一種有效的策略合成Ub-AMC,合成過(guò)程僅需通過(guò)兩片段的基于酰肼的NCL以及一鍋連接脫硫的方式就可實(shí)現(xiàn)。另外,我們使用了正亮氨酸(Nle)代替甲硫氨酸(Met)大大減少了氧化副產(chǎn)物的出現(xiàn)并提供了很高純度的最終產(chǎn)物。經(jīng)生物活性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,合成的Ub-AMC具有很好的生物活性。我們預(yù)計(jì)這種合成策略可進(jìn)一步應(yīng)用到其它泛素?zé)晒庠噭┑暮铣芍?為相關(guān)去泛素化酶的抑制劑篩查提供原料�？傊�,本篇論文圍繞發(fā)展新型策略制備泛素鏈,泛素探針以及泛素?zé)晒庠噭?三者統(tǒng)稱為泛素toolboxes)用于泛素相關(guān)生化研究。我們預(yù)計(jì)相關(guān)技術(shù)的發(fā)展將進(jìn)一步為研究泛素信號(hào)通路及其生理機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
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邐第１章邐逡逑由其它非常規(guī)位點(diǎn)（Ｍｌ，邋Ｋ６，邋Ｋｌｌ，Ｋ２７，邋Ｋ２９或Ｋ３３）所組成的單一鏈型的泛逡逑素鏈而被稱為非經(jīng)典泛素鏈，此外，非經(jīng)典泛素鏈還包括在一個(gè)多聚泛素鏈上存逡逑在多種連接類(lèi)型的混合（ｍｉｘ）或分叉（ｂｒａｎｃｈ）泛素鏈�！荆保玻葸@些泛素鏈因?yàn)樵阱义霞?xì)胞中的含量較少或是難以在體外獲得而對(duì)其功能研究的尚不深入。逡逑

邐第１章邐逡逑蛋白連接后作為一種分子信號(hào)進(jìn)行某種信號(hào)傳導(dǎo)�！荆保梗荼热�，，Ｋ６３泛素鏈可以調(diào)節(jié)逡逑ＮＦ－ｋＢ轉(zhuǎn)錄因子的激活，還可以參與免疫應(yīng)激反應(yīng)、ＤＮＡ修復(fù)和受損線粒體的逡逑清除等，此外，它們也可以與其它多種蛋白形成大型復(fù)合物從而驅(qū)使ｍＲＮＡ的逡逑剪接或翻譯。［２（）］在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)與形成Ｋ６３泛素鏈相關(guān)的Ｅ２酶和Ｅ３酶以及它的受逡逑體蛋白（ＵＢＤ）都參與相關(guān)通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而并非參與蛋白質(zhì)降解。［２１］Ｋ６３泛逡逑素鏈在體內(nèi)也有多種專一的ＤＵＢ，如ＣＹＬＤ、八＼４５１＾等［２２］。逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：Q51


本文編號(hào)：2632878