【摘要】：近年來(lái)資源危機(jī)的加劇使得人們對(duì)生物能源的需求急劇增加,木質(zhì)纖維素作為最豐富的生物質(zhì)資源,其生物轉(zhuǎn)化研究備受關(guān)注。纖維素酶特別是進(jìn)行性外切纖維素酶被認(rèn)為是生物轉(zhuǎn)化酶系的重要組成部分,對(duì)轉(zhuǎn)化速率具有重要影響。本研究對(duì)來(lái)源于地衣芽孢桿菌的GH48家族外切纖維素酶CelA進(jìn)行了基因克隆和異源表達(dá),并對(duì)該酶的酶學(xué)性質(zhì)和相關(guān)功能殘基進(jìn)行了研究,還探討了CBM結(jié)構(gòu)域?qū)elA催化特性的影響。具體研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:(1)外切纖維素酶CelA的基因克隆及異源表達(dá)對(duì)來(lái)源于地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis ATCC14580)的外切纖維素酶CelA進(jìn)行了序列分析,結(jié)果顯示該酶包含704個(gè)氨基酸,沒(méi)有明顯的信號(hào)肽和跨膜區(qū),只有一個(gè)隸屬于GH48家族的功能域。利用在線軟件對(duì)CelA進(jìn)行了同源建模,結(jié)果顯示CelA具有GH48家族酶典型的(α/α)_6桶形折疊,進(jìn)一步確定CelA為GH48家族纖維素酶。利用同源擴(kuò)增的方法從Bacillus licheniformis ATCC14580基因組中克隆了celA基因,并轉(zhuǎn)化至E.coli Rosetta(DE3)中進(jìn)行了異源表達(dá),利用親和層析純化出目的重組蛋白。(2)CelA催化特性的研究底物特異性測(cè)定結(jié)果顯示CelA以再生無(wú)定形纖維素RAC為底物時(shí)酶活力最高,其最適反應(yīng)pH值為9.0,最適反應(yīng)溫度為50℃,具有較好的溫度和pH穩(wěn)定性。Mn~(2+)和低濃度的Na~+、Fe~(2+)、Fe~(3+)對(duì)重組酶的酶活力有促進(jìn)作用;K~+、Ca~(2+)、Mg~(2+)、Zn~(2+)、Cu~(2+)、Co~(2+)、Ni~(2+)對(duì)酶活有抑制作用。甲醇、乙醇、異丙醇、β-巰基乙醇、吐溫-80、triton X-100、EDTA和高濃度的甘油使酶活力明顯下降,PMSF、尿素和低濃度的甘油對(duì)酶活力沒(méi)有顯著影響。CelA水解纖維寡糖的最小底物為纖維四糖,水解產(chǎn)物為二糖分子,水解纖維五糖的產(chǎn)物為二糖和三糖,是一種纖維二糖水解酶。(3)CelA功能位點(diǎn)的研究根據(jù)序列及結(jié)構(gòu)分析結(jié)果,確定了可能與CelA功能相關(guān)的催化殘基、底物結(jié)合殘基及隧道末端環(huán)殘基,利用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)這些位點(diǎn)的功能進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示E38、E49和D228是CelA的催化活性殘基,其中E49為質(zhì)子供體,D228為催化堿,而E38在CelA的水解過(guò)程中也起到重要作用,突變體E38A、E49A和D228N的酶活性僅為野生型的10%左右。Y100、W312和T107是隧道入口或隧道內(nèi)可能與底物結(jié)合相關(guān)的殘基,突變體Y100A、T107A及W312A的酶活性分別為野生型的34%、59%和28%,這些殘基可能參與對(duì)糖鏈進(jìn)入活性位點(diǎn)的引導(dǎo),其中芳香族殘基起到的作用更大。末端環(huán)上的氨基酸殘基E591、E592突變?yōu)榫哂行?cè)鏈的丙氨酸后,剩余酶活分別為野生型的48%和51%,說(shuō)明末端環(huán)的靈活性對(duì)產(chǎn)物釋放影響不大,可能通過(guò)與產(chǎn)物產(chǎn)生氫鍵引導(dǎo)它們排出裂隙。(4)CBM結(jié)構(gòu)域?qū)elA催化特性的影響利用融合PCR技術(shù)將CelA催化結(jié)構(gòu)域與碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域CBM串聯(lián),重組的雜合酶活性急劇下降,僅為野生型的9.8%,酶的最適反應(yīng)溫度及最適反應(yīng)pH值沒(méi)有改變,但穩(wěn)定性下降。
【圖文】：

類也能產(chǎn)生纖維素 II，但大多數(shù)如纖維素 III 和 IV，它可以通過(guò)化學(xué)處理由纖維素 I 制備[15,16]。天然纖維素主要由纖維素 Iα和 Iβ構(gòu)成， Iα和 Iβ的比例根據(jù)纖維素的來(lái)源而變化。通常，高等植物的細(xì)胞壁富含纖維素 Iβ，而纖維素 Iα主要存在于藻類或細(xì)菌的細(xì)胞壁[16,17]。纖維素 Iβ由纖維素 Iα在原纖維形成過(guò)程中彎曲轉(zhuǎn)化而成[18]。

（3）分裂性功能，一些 CBM 似乎具有破壞多糖結(jié)構(gòu)的能力，，這強(qiáng)了催化模塊的降解能力，但這種現(xiàn)象的普遍性是不確定的[90]�；K可以與不同來(lái)源的各種尺寸和結(jié)構(gòu)的 CBM 組裝，幾乎沒(méi)有限催化模塊之間的協(xié)同作用，所得的纖維小體或嵌合纖維素酶對(duì)結(jié)晶到改善。對(duì)結(jié)晶纖維素的水解活性的增強(qiáng)可間接反映 CBM 的破壞作究是零星的而不是系統(tǒng)的，各種 CBM 的破壞活性無(wú)法相互比較。在人的研究中，利用 CBM 和催化模塊的協(xié)同作用，定量分析 CBM 通過(guò)研究嵌合纖維素酶的活性，可以研究 CBMs 的特征。催化結(jié)構(gòu)域維素酶的催化結(jié)構(gòu)域分布在許多糖苷水解酶家族中， 因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的列更保守，所以一些擁有相同折疊方式和催化機(jī)制的糖苷水解酶家（GH Clan）。它代表了 CAZy 分類層級(jí)的更高級(jí)別，并且目前僅針類。通用的命名方式為：GH- 字母 ，比如：GH-A，字母僅反映氏族 家族的氏族歸屬通常遵循結(jié)構(gòu)鑒定。圖 1-2 列出了一些糖苷水解酶結(jié)構(gòu)特征。
【學(xué)位授予單位】：東北師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q78;Q936

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