【摘要】：環(huán)二鳥苷酸(c-di-GMP)是細(xì)菌中普遍存在的一種第二信使。作為細(xì)菌信號(hào)傳導(dǎo)途徑的重要組成部分,c-di-GMP可直接結(jié)合不同類型的受體分子,廣泛調(diào)控多種重要的生命活動(dòng),如運(yùn)動(dòng)性、生物膜形成與抗生素合成等。鳥苷酸環(huán)化酶(Diguanylate cyclase,DGC)和磷酸二酯酶(Phosphodiesterase,PDE)分別負(fù)責(zé)c-di-GMP的合成和降解,從而協(xié)同控制胞內(nèi)c-di-GMP的水平。通常,含有GGDEF氨基酸基序的蛋白具有鳥苷酸環(huán)化酶活性,能催化GTP產(chǎn)生c-di-GMP。而含有EAL或HD-GYP基序的蛋白具有磷酸二酯酶活性,能將c-di-GMP水解為5'-磷酸鳥苷酸-(3'-5')-鳥苷(pGpG)或鳥苷酸(GMP)。鏈霉菌(Streptomyces)是一類高GC含量的革蘭氏陽(yáng)性菌,具有復(fù)雜的形態(tài)分化過程和強(qiáng)大的次級(jí)代謝能力,能產(chǎn)生眾多具有生物學(xué)活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物,如抗生素、免疫抑制劑和抗腫瘤藥物等。研究表明,鏈霉菌的次級(jí)代謝與形態(tài)分化過程受到多層次嚴(yán)格調(diào)控,如雙組份系統(tǒng)和c-di-GMP介導(dǎo)的信號(hào)通路�，F(xiàn)有鏈霉菌中關(guān)于c-di-GMP參與形態(tài)分化與次級(jí)代謝的調(diào)控研究?jī)H限于模式菌株--委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(Streptomyces venezuelae)與天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor),而且其研究還處于起始階段。例如,天藍(lán)色鏈霉菌基因組中編碼10個(gè)可能的c-di-GMP代謝酶,但目前僅有4個(gè)功能被鑒定。因此,系統(tǒng)研究天藍(lán)色鏈霉菌中功能未知的c-di-GMP代謝酶并全面揭示它們參與形態(tài)分化或次級(jí)代謝的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)不僅具有重要的理論意義,而且也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。在本研究中我們運(yùn)用基因缺失或過表達(dá)方法,對(duì)天藍(lán)色鏈霉菌中6個(gè)功能未知的c-di-GMP代謝酶進(jìn)行了鑒定。表型分析顯示所有缺失突變菌的生長(zhǎng)和抗生素合成均未受到顯著影響。然而,過表達(dá)菌株中2個(gè)展現(xiàn)出明顯的表型變化。一方面,過表達(dá)cdgD(SCO5345)完全阻斷了菌株在R2YE或MS培養(yǎng)基中孢子的形成,并在R2YE中顯著抑制放線紫紅素(Actinorhodin,ACT)和靈菌紅素(Prodigiosin,RED)的合成。另一方面,cdgC(SCO5511)過表達(dá)后菌株在MS培養(yǎng)基中ACT產(chǎn)量顯著提升,但形態(tài)分化未受影響。隨后,本研究對(duì)CdgD的功能進(jìn)行了深入探究。定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)證明含有突變的GGDEF基序的CdgD完全喪失其調(diào)控功能。cdgD過表達(dá)后胞內(nèi)c-di-GMP濃度比野生型菌株高13-27倍。體外酶活實(shí)驗(yàn)證明CdgD能有效催化GTP形成c-di-GMP。這些結(jié)果充分表明CdgD是一個(gè)新的鳥苷酸環(huán)化酶。進(jìn)一步,本研究將天藍(lán)色鏈霉菌來(lái)源的cdgD在兩種重要的工業(yè)鏈霉菌-始旋鏈霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)和吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)中進(jìn)行了異源過表達(dá),其形態(tài)分化和相應(yīng)合成的抗生素--普那霉素I或5-酮-米爾貝霉素A3/A4的生物合成均受到了顯著抑制。這些結(jié)果初步證明c-di-GMP介導(dǎo)的形態(tài)分化與次級(jí)代謝的信號(hào)調(diào)控途徑在鏈霉菌屬中是保守的。最后,體內(nèi)定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)初步證明含有突變的GGDEF基序的CdgC過表達(dá)后不再顯著提升ACT產(chǎn)量,初步表明CdgC是一種鳥苷酸環(huán)化酶。有趣的是,cdgC過表達(dá)促進(jìn)ACT合成,但并沒有引起胞內(nèi)c-di-GMP濃度的明顯變化,其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。綜上所述,我們?cè)谔焖{(lán)色鏈霉菌中鑒定了2個(gè)新的鳥苷酸環(huán)化酶CdgC與CdgD,并系統(tǒng)研究了它們對(duì)菌株形態(tài)分化或次級(jí)代謝的調(diào)控功能。其次,我們也證明c-di-GMP介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)工業(yè)鏈霉菌生長(zhǎng)與抗生素合成均發(fā)揮重要作用。最后,cdgC過表達(dá)后ACT產(chǎn)量大幅上調(diào),這是首次觀察到鳥苷酸環(huán)化酶在鏈霉菌次級(jí)代謝過程中發(fā)揮正向調(diào)控作用,其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
【圖文】：

圖 1.1 c-di-GMP 的化學(xué)結(jié)構(gòu)式FIG. 1.1 Chemical Structure of c-di-GMP.1.1 c-di-GMP 的合成和降解

圖 1.2 c-di-GMP 的合成與降解[6]FIG. 1.2 Synthesis and degradation of c-di-GMP1.1.2 細(xì)菌胞內(nèi) c-di-GMP 濃度的調(diào)控
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q93

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1 劉小草;天藍(lán)色鏈霉菌鳥苷酸環(huán)化酶CdgC與CdgD的鑒定及其調(diào)控功能研究[D];河南大學(xué);2019年

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本文編號(hào)：2632058