【摘要】：環(huán)二鳥苷酸(c-di-GMP)是細菌中普遍存在的一種第二信使。作為細菌信號傳導(dǎo)途徑的重要組成部分,c-di-GMP可直接結(jié)合不同類型的受體分子,廣泛調(diào)控多種重要的生命活動,如運動性、生物膜形成與抗生素合成等。鳥苷酸環(huán)化酶(Diguanylate cyclase,DGC)和磷酸二酯酶(Phosphodiesterase,PDE)分別負責(zé)c-di-GMP的合成和降解,從而協(xié)同控制胞內(nèi)c-di-GMP的水平。通常,含有GGDEF氨基酸基序的蛋白具有鳥苷酸環(huán)化酶活性,能催化GTP產(chǎn)生c-di-GMP。而含有EAL或HD-GYP基序的蛋白具有磷酸二酯酶活性,能將c-di-GMP水解為5'-磷酸鳥苷酸-(3'-5')-鳥苷(pGpG)或鳥苷酸(GMP)。鏈霉菌(Streptomyces)是一類高GC含量的革蘭氏陽性菌,具有復(fù)雜的形態(tài)分化過程和強大的次級代謝能力,能產(chǎn)生眾多具有生物學(xué)活性的次級代謝產(chǎn)物,如抗生素、免疫抑制劑和抗腫瘤藥物等。研究表明,鏈霉菌的次級代謝與形態(tài)分化過程受到多層次嚴格調(diào)控,如雙組份系統(tǒng)和c-di-GMP介導(dǎo)的信號通路�，F(xiàn)有鏈霉菌中關(guān)于c-di-GMP參與形態(tài)分化與次級代謝的調(diào)控研究僅限于模式菌株--委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(Streptomyces venezuelae)與天藍色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor),而且其研究還處于起始階段。例如,天藍色鏈霉菌基因組中編碼10個可能的c-di-GMP代謝酶,但目前僅有4個功能被鑒定。因此,系統(tǒng)研究天藍色鏈霉菌中功能未知的c-di-GMP代謝酶并全面揭示它們參與形態(tài)分化或次級代謝的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)不僅具有重要的理論意義,而且也具有潛在的應(yīng)用價值。在本研究中我們運用基因缺失或過表達方法,對天藍色鏈霉菌中6個功能未知的c-di-GMP代謝酶進行了鑒定。表型分析顯示所有缺失突變菌的生長和抗生素合成均未受到顯著影響。然而,過表達菌株中2個展現(xiàn)出明顯的表型變化。一方面,過表達cdgD(SCO5345)完全阻斷了菌株在R2YE或MS培養(yǎng)基中孢子的形成,并在R2YE中顯著抑制放線紫紅素(Actinorhodin,ACT)和靈菌紅素(Prodigiosin,RED)的合成。另一方面,cdgC(SCO5511)過表達后菌株在MS培養(yǎng)基中ACT產(chǎn)量顯著提升,但形態(tài)分化未受影響。隨后,本研究對CdgD的功能進行了深入探究。定點突變實驗證明含有突變的GGDEF基序的CdgD完全喪失其調(diào)控功能。cdgD過表達后胞內(nèi)c-di-GMP濃度比野生型菌株高13-27倍。體外酶活實驗證明CdgD能有效催化GTP形成c-di-GMP。這些結(jié)果充分表明CdgD是一個新的鳥苷酸環(huán)化酶。進一步,本研究將天藍色鏈霉菌來源的cdgD在兩種重要的工業(yè)鏈霉菌-始旋鏈霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)和吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)中進行了異源過表達,其形態(tài)分化和相應(yīng)合成的抗生素--普那霉素I或5-酮-米爾貝霉素A3/A4的生物合成均受到了顯著抑制。這些結(jié)果初步證明c-di-GMP介導(dǎo)的形態(tài)分化與次級代謝的信號調(diào)控途徑在鏈霉菌屬中是保守的。最后,體內(nèi)定點突變實驗初步證明含有突變的GGDEF基序的CdgC過表達后不再顯著提升ACT產(chǎn)量,初步表明CdgC是一種鳥苷酸環(huán)化酶。有趣的是,cdgC過表達促進ACT合成,但并沒有引起胞內(nèi)c-di-GMP濃度的明顯變化,其具體機制有待進一步研究。綜上所述,我們在天藍色鏈霉菌中鑒定了2個新的鳥苷酸環(huán)化酶CdgC與CdgD,并系統(tǒng)研究了它們對菌株形態(tài)分化或次級代謝的調(diào)控功能。其次,我們也證明c-di-GMP介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對工業(yè)鏈霉菌生長與抗生素合成均發(fā)揮重要作用。最后,cdgC過表達后ACT產(chǎn)量大幅上調(diào),這是首次觀察到鳥苷酸環(huán)化酶在鏈霉菌次級代謝過程中發(fā)揮正向調(diào)控作用,其具體機制有待進一步研究。
【圖文】：

圖 1.1 c-di-GMP 的化學(xué)結(jié)構(gòu)式FIG. 1.1 Chemical Structure of c-di-GMP.1.1 c-di-GMP 的合成和降解

圖 1.2 c-di-GMP 的合成與降解[6]FIG. 1.2 Synthesis and degradation of c-di-GMP1.1.2 細菌胞內(nèi) c-di-GMP 濃度的調(diào)控
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q93

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1 劉小草;天藍色鏈霉菌鳥苷酸環(huán)化酶CdgC與CdgD的鑒定及其調(diào)控功能研究[D];河南大學(xué);2019年

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本文編號：2632058