【摘要】：白沙蒿(Artemisia sphaerocephala)為菊科蒿屬沙生灌木,對(duì)荒漠生態(tài)系統(tǒng)的維持和恢復(fù)具有重要意義,同時(shí)其富含亞油酸、維生素E等,具有一定保健功效。隨白沙蒿轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的完成,對(duì)該物種基因功能的認(rèn)知迫切。病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技術(shù)不需建立遺傳轉(zhuǎn)化體系,可快速驗(yàn)證植物基因功能,在非模式植物中被廣泛應(yīng)用。PDS(Phytoene desaturase,PDS)基因是合成類胡蘿卜素的關(guān)鍵基因,該基因被沉默導(dǎo)致葉綠素合成途徑被阻斷,植物呈易分辨的“光漂白”表型,是探索VIGS體系的首選基因。本研究以白沙蒿為材料,選用煙草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)為載體,PDS為目標(biāo)基因,構(gòu)建正反向重組載體。以注射法(Injection method,I)、真空滲透(Vacuum infiltration,V)、真空滲透+超聲波(Vacuum infiltration+ultrasonic,V+U)三種接種方法,OD_(600)=0.5、0.8、1.0、1.5四種菌液濃度,將含有重組載體的農(nóng)桿菌菌液對(duì)子葉期和真葉期幼苗分別各處理24組,探索VIGS體系在白沙蒿中的可行性。主要結(jié)果如下:(1)克隆得到441 bp白沙蒿PDS基因片段AsPDS-F和AsPDS-R,構(gòu)建出TRV病毒的正反向重組載體pTRV_2-AsPDS-F、pTRV_2-AsPDS-R。(2)子葉期VIGS體系建立受接種方法、菌液濃度和靶基因插入方向的極顯著影響。子葉期VIGS體系最佳處理組為V+U-1.5-R,白化程度達(dá)0.72,白化部位在第一、二對(duì)真葉處。(3)真葉期白沙蒿VIGS體系的建立,分別受接種方法和菌液濃度極顯著和顯著影響,靶基因插入方向?qū)w系的建立無影響。真葉期白沙蒿VIGS最佳處理組為I-1.5-R,其白化程度為0.34,白化部位在第三、四對(duì)真葉處。(4)子葉期白沙蒿VIGS體系中14組處理產(chǎn)生陽(yáng)性植株,白化程度總均值為0.15;真葉期5組處理產(chǎn)生陽(yáng)性植株,白化程度總均值為0.05。子葉期產(chǎn)生的陽(yáng)性植株和白化程度均優(yōu)于真葉期。本研究在白沙蒿中建立了快速、高效的功能基因沉默體系,為后續(xù)該物種的基因功能研究提供了技術(shù)支撐。
【圖文】：

2008; Voinnet, 2001)。其中，已在高等植物中廣因沉默（Post-transcription gene silencing，PTGS），而錄后的基因沉默(Holzberget al., 2010; Ruiz and Baulc入，病毒誘導(dǎo)的基因沉默用于表征基因功能的一種基導(dǎo)基因沉默體系的作用機(jī)制一種 RNAi（RNA interference，RNA 干擾）下調(diào)基因的病毒侵染宿主，，向下調(diào)控內(nèi)源基因的表達(dá)水平并引究靶基因功能(Fuet al., 2002; Kammen, 1997)。最早，式植物本氏煙草的研究(Burch-Smith et al., 2006)，這理論基礎(chǔ)。病毒誘導(dǎo)的基因沉默包含 3 個(gè)關(guān)鍵步驟：段與合適的病毒載體進(jìn)行重組；第二，將含有病毒載主植物；第三，利用植物抵抗病毒感染的防衛(wèi)機(jī)制沉VIGS 機(jī)理屬于 RNA 沉默范疇，包含兩條途徑。

圖 3-1 AsPDS-F、AsPDS-R 基因片段的獲得在大腸桿菌中的檢測(cè)化的 AsPDS-F、AsPDS-R 基因與線性載體連接后，轉(zhuǎn)陽(yáng)性單克隆。體 pTRV2-AsPDS-F 在大腸桿菌中的檢測(cè)的 7 個(gè)陽(yáng)性單克隆，進(jìn)行菌液檢測(cè)。均獲得單一清晰條帶（圖 3-2），分別將其回收測(cè)序，得到序列信息結(jié)果，發(fā)現(xiàn)第 6 泳道目的片段與白沙蒿 PDS 序列一，無堿基突變（圖 3-3），重組載體 pTRV2-AsPDS-F
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q943.2

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本文編號(hào)：2632491