【摘要】：目的:本研究以安徽省揚子鱷(Alligator sinensis)繁殖研究中心提供揚子鱷眼球為研究對象,通過免疫組織化學(xué)染色和免疫熒光染色分析并觀察一氧化氮合酶(NOS)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)在揚子鱷眼球中的表達及分布情況,從而為后續(xù)探討B(tài)DNF和NOS在揚子鱷視覺形成中的作用提供實驗基礎(chǔ)。方法:查詢NCBI GenBank公共數(shù)據(jù)庫中的人(accession no:NP_000616.3)、家兔(accession no:AAB68663.1)、非洲爪蟾(accession no:AAD55136.2)、斑馬魚(accession no:NP_571735.1)的NOS和以及人(accession no:CAA62632.1),家兔(accession no:XP_017201122.1),非洲爪蟾(accession no:AAH82887.1),斑馬魚(accession no:AAH66468.1)的BDNF蛋白氨基酸序列,利用MEGA軟件對NOS和BDNF的氨基酸序列進行序列同源性比對和分析。取新鮮的鱷魚眼球并立即用4%多聚甲醛固定,剔除周圍的結(jié)締組織,OCT包埋后進行冰凍切片,切片厚度為6μm。將切片在室溫晾置20 min后,PBST漂洗三次,每次10 min,在組織周圍用免疫組化筆畫圈后滴加H_2O_2封閉30 min,然后滴加一抗(稀釋比例分別為兔抗BDNF抗體為1:200,鼠抗nNOS抗體為1:200),置于濕盒內(nèi)于4℃孵育過夜。次日將片子取出,PBST洗3次,每次10min。分別滴加HRP標記的羊抗兔IgG抗體和HRP標記的兔抗鼠IgG抗體,室溫孵育1小時,PBST洗3次,每次10min,DAB顯色液顯色后,光鏡下觀察BDNF和nNOS在眼球中的表達;HE染色觀察成年揚子鱷眼球切片的結(jié)構(gòu)。將新鮮的鱷魚眼球取出后立即用4%多聚甲醛固定,將周圍結(jié)締組織清除干凈,OCT包埋后進行冰凍切片,切片厚度為6μm。將切片在室溫晾置20 min后,PBST洗三次,每次10 min,在組織周圍用免疫組化筆畫圈后滴加入5%馬血清封閉30 min后,分別滴加兔抗BDNF抗體(稀釋比列為1:200)和鼠抗nNOS抗體(稀釋比列為1:200)后,置于濕盒內(nèi)于4℃冰箱孵育過夜。次日將片子取出,PBST洗3次,每次10min。滴加二抗(同時加入驢抗小鼠-594,驢抗兔-488,稀釋比例均為1:1000),室溫孵育2小時后,PBST洗3次,每次10min。滴加DAPI(1:1000)染核10 min后,PBST洗10min。甘油封片后于激光共聚焦顯微鏡拍照,觀察NOS、BDNF在眼球中的分布情況。結(jié)果:通過生物學(xué)分析發(fā)現(xiàn)NOS和BDNF蛋白氨基酸序列在不同物種之間存在差異性,NOS蛋白氨基酸序列中,家兔和非洲爪蟾的同源性最高,為76.70%,其次為非洲爪蟾與斑馬魚的同源性74.02%;BDNF蛋白氨基酸序列中,人和非洲爪蟾的同源性最高,為85.48%,其次為人和家兔的同源性72.95%。HE染色可觀察到揚子鱷眼球鞏膜、脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)清晰。免疫組織化學(xué)染色明顯發(fā)現(xiàn)BDNF在揚子鱷眼球切片的脈絡(luò)膜層和視網(wǎng)膜層表達,而NOS主要在視網(wǎng)膜層表達。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)BDNF和NOS在視網(wǎng)膜層共同表達,二者在視網(wǎng)膜層出現(xiàn)共存現(xiàn)象。結(jié)論:1.BDNF在揚子鱷眼球切片的脈絡(luò)膜層和視網(wǎng)膜層表達,而NOS主要在視網(wǎng)膜層表達,二者在視網(wǎng)膜層共同表達并出現(xiàn)共存現(xiàn)象。2.BDNF和NOS在揚子鱷的眼球中均有表達且共存,可能參與揚子鱷視覺形成的調(diào)節(jié)。
【圖文】：

觀察到的揚子鱷眼球結(jié)構(gòu)，藍色、綠色和紅色箭頭依次指示為鞏膜、脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜；圖 C和圖 D在揚子鱷眼球的不同部位觀察其結(jié)構(gòu)。圖3 揚子鱷眼球顯微鏡下結(jié)構(gòu)圖（40×和100×）3 觀察 NOS 和 BDNF 在揚子鱷眼球中表達情況3.1免疫組化染色觀察NOS和BDNF在揚子鱷眼球中的表達情況在不同倍鏡下觀察BDNF和NOS的免疫陽性表達的強度，結(jié)果顯示NOS和BDNF在揚子鱷眼球中表達。圖4A在不同倍鏡下清晰觀察到NOS陽性表達，圖4B在不同倍鏡下清晰觀察到BDNF陽性表達。

圖 4 NOS 和 BDNF 在揚子鱷眼球中的表達情況3.2 熒光染色觀察NOS和BDNF在揚子鱷眼球中表達情況通過熒光染色觀察NOS和BDNF在揚子鱷眼球中表達情況，圖5A綠色為BDNF陽性，圖5B紅色為NOS陽性，，結(jié)果顯示BDNF陽性表達在切片的中層和內(nèi)層，高倍鏡顯示BDNF陽性細胞表達在脈絡(luò)膜層和視網(wǎng)膜層，NOS陽性細胞主要表達在視網(wǎng)膜層。
【學(xué)位授予單位】：皖南醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q436

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本文編號：2625485