背景和目的:人血小板衍生因子-BB(PDGF-BB)能夠促進(jìn)多種細(xì)胞增殖,參與新生血管的生成及抗凋亡等作用,臨床用來治療皮膚燒傷和重度糖尿病患者的皮膚創(chuàng)傷。構(gòu)建PDGF-BB優(yōu)化酶切位點(diǎn)后的表達(dá)載體,篩選出穩(wěn)定遺傳和高表達(dá)的PDGF-BB的X33畢赤酵母菌株,摸索PDGF-BB重組蛋白的純化條件,進(jìn)行蛋白定量和活性測定。方法:通過查詢基因組文庫并設(shè)計(jì)目的序列,構(gòu)建pPICZαA-PDGF-BB-Fc表達(dá)載體,利用BTX方波電穿孔儀電擊轉(zhuǎn)化到X33畢赤酵母工程菌中表達(dá)PDGF-BB蛋白,通過含有博來霉素的YPD固體培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定的PDGF-BB表達(dá)菌株。通過對(duì)不同誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間和誘導(dǎo)表達(dá)的甲醇濃度條件的優(yōu)化。然后表達(dá)的蛋白經(jīng)過鹽析初步純化,DEAE陰離子交換層析,Superdex75凝膠過濾層析進(jìn)一步純化目的蛋白,為后續(xù)的大規(guī)模的發(fā)酵提供可參考的方案和工藝。結(jié)果:成功地構(gòu)建了PDGF-BB重組蛋白的表達(dá)載體,獲得了穩(wěn)定遺傳且表達(dá)量相對(duì)高的重組蛋白菌株。初步建立了完整的PDGF-BB重組蛋白分離純化體系,純化的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測純度達(dá)90%,經(jīng)過活性測定結(jié)果顯示,重組的PDGF-BB蛋白具有生物學(xué)活性能夠刺激成纖維細(xì)胞增殖。結(jié)論:通過構(gòu)建PDGF-BB重組蛋白的表達(dá)載體,優(yōu)化了重組蛋白的表達(dá)和純化條件,獲得了高純度的PDGF-BB重組蛋白,純度達(dá)90%,并具有良好的生物學(xué)活性。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q78

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本文編號(hào)：2625359