【摘要】：非編碼RNA(noncoding RNA,ncRNA),即轉(zhuǎn)錄,但不翻譯成蛋白質(zhì)的RNA。隨著高通量測序技術的發(fā)展,數(shù)十萬條非編碼RNA已被鑒定和注釋,并發(fā)現(xiàn)作為生物學功能的重要調(diào)控因子廣泛的存在于哺乳動物和其他物種體內(nèi)。對于這些非編碼RNA的功能和機制研究,是當前生物領域的前沿和熱點之一。在已有的非編碼RNA功能研究工作中,許多非編碼RNA被發(fā)現(xiàn)通過結(jié)合在染色質(zhì)來調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄,如XIST,HOTAIR,MALAT1等。這種方式目前被認為是非編碼RNA,尤其是長鏈非編碼RNA(lncRNA)行使功能的主要方式之一。長鏈非編碼RNA既可以通過招募染色質(zhì)修飾蛋白來調(diào)節(jié)染色質(zhì)狀態(tài),也可以通過連接基因啟動子區(qū)域和遠端增強子區(qū)域直接調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。另一方面,由于仍有90%以上的非編碼RNA功能尚未被研究,領域內(nèi)也致力于發(fā)展全基因組水平的非編碼RNA功能篩選技術,如利用CRISPR為基礎的CRISPRi-screen技術,來篩選在細胞增殖中發(fā)揮功能的lncRNA。盡管如此,目前依然十分缺乏對非編碼RNA和染色質(zhì)結(jié)合的系統(tǒng)性研究。在此背景下,我們開發(fā)了名為 PIRCh-seq(Profiling Interacting RNAs on Chromatin)的測序技術。該技術可利用不同組蛋白抗體或組蛋白修飾抗體,如H3、H3K4me3、H3K27ac等,富集結(jié)合在對應區(qū)域上的非編碼RNA,之后利用高通量測序技術,實現(xiàn)在組蛋白修飾這一表觀基因組水平,定性并定量的分析和染色質(zhì)結(jié)合的非編碼RNA。利用PIRCh-seq,我們一方面可以篩選到細胞內(nèi)和染色質(zhì),尤其是不同修飾狀態(tài)下的染色質(zhì)結(jié)合的非編碼RNA,系統(tǒng)性的描述非編碼RNA和染色質(zhì)的結(jié)合特征,另一方面通過開發(fā)新的生物信息學算法和模型,深入研究和染色質(zhì)結(jié)合的非編碼RNA的功能及其對基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用機制。我們分別在人和小鼠共5種細胞系上(HFF,H9,mESC,MEF和NPC),獲得了 7種不同的組蛋白及組蛋白修飾(H3,H3K4me1,H3K4me3,H3K9me3,H3K27me3,H3K27ac,和H4K16ac)抗體的PIRCh-seq結(jié)果。通過對比不用抗體的Input對照組,我們發(fā)現(xiàn)PIRCh-seq能準確的捕獲到和染色質(zhì)結(jié)合非編碼RNA,并且不同組蛋白修飾的染色質(zhì)會明顯富集不同的非編碼RNA,例如XST作為一個沉默X染色體基因表達的最重要的非編碼RNA,只檢測到在H3K27me3修飾的組蛋白上富集。通過對比之前已發(fā)表的染色質(zhì)結(jié)合非編碼RNA檢測技術,我們發(fā)現(xiàn)PIRCh-seq在去除初生轉(zhuǎn)錄本這一主要噪音信號的效果,顯著優(yōu)于其他方法,并且該效果在不同組蛋白修飾抗體上表現(xiàn)穩(wěn)定。進一步的分析結(jié)果顯示,相比于mRNA,非編碼RNA在整體上更具有染色質(zhì)結(jié)合偏好性,其中長鏈非編碼RNA占主要比例(90%以上)。在小鼠胚胎干細胞V6.5中,我們通過一系列生物信息分析,最終篩選獲得了 258個染色質(zhì)結(jié)合非編碼RNA,其中絕大部分非編碼RNA的功能是未曾被研究過的。為了研究相關非編碼RNA和染色質(zhì)的結(jié)合模式及其功能,我們對數(shù)據(jù)進行了降維展示和無監(jiān)督聚類。結(jié)果顯示存在6種非編碼RNA和染色質(zhì)的結(jié)合模式,分別對應于不同的染色質(zhì)狀態(tài),如H3K4me1和H3K27ac代表的啟動子,H3K4me3和H3K27ac代表的增強子,H3K27me3代表的轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)域等。該結(jié)果說明染色質(zhì)結(jié)合非編碼RNA可能是通過結(jié)合到不同狀態(tài)下染色質(zhì)區(qū)域,發(fā)揮不同的調(diào)控功能。進一步比較染色質(zhì)結(jié)合非編碼RNA臨近基因的表達水平,我們可以觀察到臨近編碼基因轉(zhuǎn)錄水平和非編碼RNA和染色質(zhì)的結(jié)合狀態(tài)成正相關,說明大多數(shù)非編碼RNA都順式調(diào)控其周圍編碼基因的表達。通過整合分析小鼠不同細胞系的PIRCh-seq結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)結(jié)合非編碼RNA同樣具有細胞種類特異性,只有為數(shù)不多的非編碼RNA在多個細胞系的染色質(zhì)中均有富集。有趣的是,我們發(fā)現(xiàn)有部分非編碼RNA,如ub008bcq.1,在胚胎干細胞中會同時富集在染色質(zhì)活躍和抑制區(qū)域,說明它們在干細胞中可能具有增強和抑制基因表達的雙重功能,而在終末分化的細胞系中,這些非編碼RNA卻只富集在染色質(zhì)活躍或者抑制區(qū)域,說明它們在分化后的細胞中可能只具備增強或者抑制基因表達的單重功能。為了進一步探究非編碼RNA和染色質(zhì)結(jié)合的機制,我們整合已發(fā)表的RNA二級結(jié)構(gòu)icSHAPE數(shù)據(jù)和RNA m6A甲基化修飾數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)非編碼RNA和染色質(zhì)的結(jié)合位點更傾向于單鏈結(jié)構(gòu),并且RNA上的突變位點產(chǎn)生的RNA結(jié)構(gòu)變化都會影響其和染色質(zhì)的結(jié)合能力。最后,為了進一步證實PIRCh-seq所發(fā)現(xiàn)的染色質(zhì)結(jié)合非編碼RNA的確具有潛在的生物學功能,我們挑選小鼠神經(jīng)前體細胞中所篩選到的一個結(jié)合在H3K4me3上的非編碼RNA lnc-Nr2f1。我們對lnc-Nr2f1進行ChIRP-seq實驗,鑒定其在全基因組水平上染色質(zhì)的結(jié)合位點。結(jié)合組蛋白修飾ChIP-seq實驗結(jié)果顯示lnc-Nr2f1確實主要結(jié)合H3K4me3修飾區(qū)域,這與我們PIRCh-seq結(jié)果高度一致。同時對ChIRP-seq發(fā)現(xiàn)的lnc-Nr2f1結(jié)合基因功能分析,我們發(fā)現(xiàn)lnc-Nr2f1具有調(diào)控神經(jīng)細胞發(fā)育的能力。綜上所述,本研究工作開發(fā)的PIRCh-seq技術可以有效的富集不同組蛋白修飾狀態(tài)下的染色質(zhì)結(jié)合的非編碼RNA。該技術對系統(tǒng)性的揭示非編碼RNA和染色質(zhì)的互作機理有重要的科學意義,并為進一步研究非編碼RNA對基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控機制提供了新的方法和手段,將有可能在非編碼RNA研究領域有廣泛的應用前景。
【圖文】：

圖１．１主要的組蛋白修飾位點及其結(jié)合的染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子一覽（Ａｎｄｒｅｗ邋Ｊ邋Ｂａｎｎｉｓｔｅｒ＆逡逑Ｔｏｎｙ邋Ｋｏｕｚａｒｉｄｅｓ，邋２０１１）逡逑１．１．２邐Ｈ３Ｋ４ｍｅｌ逡逑組蛋白３上４號位賴氨酸單甲基化，通常出現(xiàn)在染色質(zhì)增強子位置，可結(jié)合逡逑先導轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子如＞Ｗ７／ＳＡ／Ｆ（ＳＷＩｔｃｈ／ＳｕｃｒｏｓｅＮｏｎ－Ｆｅｒｍｅｎｔａｂｌｅ），是具有激活轉(zhuǎn)逡逑錄性質(zhì)的組蛋白修飾（Ｚａｒｅｔ邋ａｎｄ邋Ｃａｒｒｏｌｌ，邋２０１１）。該修飾通常由／／ＸＭＴ（Ｈｉｓｔｏｎｅ逡逑Ｌｙｓｉｎｅ邋Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）家族蛋白甲基化形成，其中ｉＳ￡ｒ７／９是主要的Ｈ３Ｋ４單甲逡逑基化酶（Ｘｉａｏ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００３），并由邋ＬＳＺ）／（Ｌｙｓ丨ｎｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ邋ｈｉｓｔｏｎｅ邋ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ邋１）擦除甲逡逑基化（Ｓｈｉ邋ｅｔ邋ａｌ．，，２００４）。雖然Ｈ３Ｋ４ｍｅｌ如何建立在增強子區(qū)域的機制仍不明確，逡逑但近期有研宄在全蛋白組學水平的鑒定了增強子區(qū)域Ｈ３Ｋ４ｍｅｌ所結(jié)合的蛋白質(zhì)逡逑組，有望進一步闡述該修飾的形成原因和發(fā)揮功能的機制（Ｌｏｃａｌ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１８）。逡逑１．１．３邐Ｈ３Ｋ４ｍｅ３逡逑

主要的染色質(zhì)結(jié)合ｎｃＲＮＡ的功能和分子機制，闡明染色質(zhì)結(jié)合ｎｃＲＮＡ在分子逡逑和細胞生物學中的作用。逡逑１．３．１順式調(diào)節(jié)的染色質(zhì)結(jié)合ｎｃＲＮＡ邋（圖１．２）逡逑６逡逑
【學位授予單位】：中國科學技術大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q75

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1 方靖文;PIRCh-seq研究非編碼RNA和染色質(zhì)結(jié)合的功能與機制[D];中國科學技術大學;2019年

本文編號：2620084