發(fā)布時(shí)間：2020-04-08 22:30

【摘要】：褪黑素(N-乙�；�-甲氧基色胺,melatonin,MT)在動(dòng)物體內(nèi)中具有抗氧化作用,植物體內(nèi)可能有類(lèi)似功能。作為一種多效信號(hào)分子,MT能增強(qiáng)植物對(duì)各種生物和非生物脅迫的耐受性,在植物生長(zhǎng)、發(fā)育和環(huán)境脅迫中具有重要作用。研究資料顯示MT誘導(dǎo)植物抗氧化酶活性,增強(qiáng)植物的抗逆性能,在綠藻中同樣表現(xiàn)著良好的鹽脅迫防御特性,但是MT抗氧化保護(hù)作用的機(jī)制還有很多未知�！熬G色酵母”萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是一種單細(xì)胞綠藻,生長(zhǎng)速度快,分子遺傳學(xué)背景簡(jiǎn)單,常被當(dāng)做模式微藻用于植物功能基因及次生代謝產(chǎn)物等研究。禾本科燕麥屬植物莜麥又稱(chēng)裸燕麥(Avena nuda L.),是我國(guó)高寒山區(qū)特有的優(yōu)質(zhì)雜糧之一,具有獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能,但是其生長(zhǎng)受到非生物脅迫限制,制約其利用和發(fā)展。二者的研究中,有關(guān)MT功能資料還很匱乏,鹽脅迫條件下單細(xì)胞藻類(lèi)和高等植物莜麥中的MT功能研究薄弱。本研究分別以萊茵衣藻和莜麥為實(shí)驗(yàn)材料,探討MT在植物中的抗氧化功能。具體包含兩部分內(nèi)容:一部分是借助微藻基因工程的反義RNA技術(shù),玻璃珠法轉(zhuǎn)化萊茵衣藻CC-503,獲得MT合酶基因AANAT沉默的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻,進(jìn)而探討鹽脅迫下萊茵衣藻生長(zhǎng)及抗氧化變化;另一部分關(guān)注外源施加MT條件下,高等植物莜麥的鹽脅迫響應(yīng)。通過(guò)本論文探討鹽脅迫中MT對(duì)植物生長(zhǎng)的保護(hù)力,為植物中MT的功能研究提供參考,推動(dòng)MT在藻類(lèi)及植物中的功能研究。主要研究?jī)?nèi)容如下:(1)構(gòu)建了含目的基因aanat的萊茵衣藻核反義表達(dá)載體pDBle-aanat:將已獲得的含有目的片段aanat的克隆載體pMD18-aanat雙酶切并純化回收目的片段,然后用T4-DNA連接酶將aanat基因片段反向連接到pDBle載體上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)PCR、雙酶切和測(cè)序進(jìn)行鑒定目的菌株的鑒定,結(jié)果表明表達(dá)載體構(gòu)建正確。(2)萊茵衣藻的遺傳轉(zhuǎn)化及篩選鑒定,獲得轉(zhuǎn)化藻株:萊茵衣藻的遺傳轉(zhuǎn)化及篩選鑒定,轉(zhuǎn)化藻株經(jīng)過(guò)博來(lái)霉素(Ble)抗性篩選培養(yǎng)后,再提取轉(zhuǎn)化衣藻的DNA和RNA,分別進(jìn)行ble基因PCR檢測(cè)及AANAT基因表達(dá)水平qRT-PCR的檢測(cè)等方法,最終獲得了陽(yáng)性藻株ARn(n為不同轉(zhuǎn)基因藻系),并證明了aanat基因成功整合進(jìn)了衣藻核基因組中并下調(diào)了AANAT基因的表達(dá)。(3)轉(zhuǎn)基因藻株的生長(zhǎng)情況:分別測(cè)定野生型藻(WT)和ARn藻系的OD值,連續(xù)7 d數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示,ARn系的生長(zhǎng)曲線(xiàn)趨勢(shì)與WT藻系基本相一致,沒(méi)有受到外源aanat基因整合的影響,只是轉(zhuǎn)基因藻細(xì)胞密度較低。但是測(cè)定的不同ARn藻系中MT的含量平均為10.37 pg/mL,低于野生藻(MT含量為11.86 pg/mL),證實(shí)萊茵衣藻核基因組中AANAT基因沉默降低了MT的合成。(4)aanat基因沉默微藻(內(nèi)源MT)在鹽脅迫處理中的生理響應(yīng):(1)測(cè)定了不同藻株細(xì)胞內(nèi)MT濃度,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化藻株AR_3中MT濃度均顯著(p0.05)地低于未轉(zhuǎn)化藻株,說(shuō)明AANAT基因沉默藻株AR_3在鹽脅迫后MT含量降低;(2)在50 mM和100 mM NaCl脅迫環(huán)境中,與WT衣藻相比,AR_3藻株中清除活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)的能力較弱一些;抗氧化物酶活性和基因的表達(dá)情況均降低/下調(diào)。此結(jié)果說(shuō)明了AR_3清除ROS和恢復(fù)細(xì)胞損傷的能力減弱。(5)外源MT對(duì)莜麥鹽脅迫下的防護(hù)作用:(1)在150 mM NaCl鹽脅迫下,外施不同濃度MT處理后,莜麥的株高、莖粗、鮮重、干重、葉綠素含量、葉面積和葉體積均增加;而葉綠素合成酶基因(ChlG)的表達(dá)量平均提高了6.40倍。這些結(jié)果說(shuō)明MT有利于植物生長(zhǎng);(2)在150 mM NaCl鹽脅迫下,外施不同濃度MT處理后,莜麥幼苗葉片過(guò)氧化氫(H_2O_2)、超氧陰離子(O_2~(·-))和MDA含量減少;超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)的活性均提高。該結(jié)果顯示出MT可以提高植物抗氧化能力,可能是通過(guò)清除細(xì)胞ROS和增加抗氧化物酶的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)這一功能;(3)150 mM NaCl鹽脅迫下,外施不同濃度MT處理后,滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸的含量均增加;而細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白含量則降低;細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物酶基因(LOX和POX)表達(dá)量均上調(diào)。這些結(jié)果證實(shí)了在莜麥中脯氨酸可能是主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),同時(shí)也證實(shí)了MT可以誘導(dǎo)細(xì)胞抗鹽性相關(guān)基因的表達(dá),進(jìn)而提高植物對(duì)鹽脅迫的耐受性;(4)在150 mM NaCl鹽脅迫下,外施不同濃度MT處理后促分裂原活化白激酶(MAPK)級(jí)聯(lián)途徑中的MAPK蛋白激酶(Asmap1和Aspk11)基因表達(dá)量均上調(diào)以及轉(zhuǎn)錄因子(TFs)NAC、WRKY1、WRKY3和MYB的表達(dá)量也均上調(diào)。這些結(jié)果揭示了MT在鹽脅迫緩解中的重要作用,推測(cè)MT可能有類(lèi)似與油菜素內(nèi)酯(BRs)的作用,即通過(guò)介導(dǎo)MAPK介導(dǎo)H_2O_2信號(hào)通路,促進(jìn)抗鹽脅迫相關(guān)基因表達(dá),進(jìn)而提高莜麥對(duì)鹽脅迫的耐受性。不管是MT合酶基因AANAT的低表達(dá)實(shí)驗(yàn),還是外施MT實(shí)驗(yàn)均證實(shí)了MT的確具有抗氧化的功能。
【圖文】：

圖 1 MT 在植物和動(dòng)物中的生物合成途徑[43]e 1 Biosynthetic pathway of MT in plants and in animals[4長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控作用早被關(guān)注的是其可以作為生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)植物的生長(zhǎng)在黃化的羽扇豆中已經(jīng)得到證實(shí)[44]。與生長(zhǎng)素（I可促進(jìn)下胚軸的生長(zhǎng)，較高濃度則具有抑制作用。內(nèi)濃度梯度分布，推測(cè)與下胚軸的不同生長(zhǎng)潛力有關(guān)。物中也有被證實(shí)[8]。外源性 MT 促進(jìn)不同植物組織生的行為[45]，在紅甘藍(lán)[46]和芥菜[47]中 MT 具有促進(jìn)/抑 MT 之間的關(guān)系還未得到證實(shí)，但它似乎可以并行A 的促進(jìn)根莖生成的功能，MT 能夠從羽扇豆中的周根或側(cè)根[48]。這種根莖效應(yīng)已在其他物種中也有研。另外在體外應(yīng)用中，MT 作為細(xì)胞保護(hù)劑（抗氧化

胞對(duì)應(yīng)激的反應(yīng)主要由細(xì)胞外物質(zhì)與質(zhì)膜蛋白的相互作用引發(fā)，這意味著植上存在應(yīng)激的受體。細(xì)胞膜受體將應(yīng)激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到下游，引發(fā)產(chǎn)生包括 C 的第二信使，已經(jīng)鑒定出許多轉(zhuǎn)錄因子（TFs），可以被 MT 上調(diào)[64]，MT 錄物中也有與氧化還原穩(wěn)態(tài)相關(guān)的基因，這些基因與生物和/或非生物脅迫。MT 也調(diào)節(jié)與特定應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)。例如，，MT 通過(guò)下調(diào)葉綠素酶（CLH表達(dá)[63]維持葉綠素含量，MT 也可通過(guò)下調(diào)了 PAO 基因的表達(dá)減緩蘋(píng)果葉55]。高鹽脅迫過(guò)程由于滲透勢(shì)的變化會(huì)產(chǎn)生離子毒性[11]。NHX1 和 AKT1 是基因有助于維持離子穩(wěn)態(tài)。植物葉片中 NHX1 和 AKT1 基因表達(dá)的上調(diào)，有植物的耐鹽性[74]。此外，MT 可上調(diào) C 重復(fù)結(jié)合因子（CBFs）/干旱反應(yīng)元子（DREBs）的表達(dá)，進(jìn)而激活 CAMTA1 和 ROS 相關(guān)的抗氧化基因 ZAT12 的轉(zhuǎn)錄激活，減少冷脅迫對(duì)植物的傷害[99]。MT 在調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)中作用，反映其在植物中的多效生理作用[63]。據(jù)記載，MT 還可通過(guò)直接猝滅響有毒金屬的螯合作用進(jìn)而提高植物對(duì)金屬離子脅迫的耐受性[75]。
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：Q945

【參考文獻(xiàn)】

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3 劉杰;崔建升;田程;劉鵬程;;微藻保存技術(shù)[J];中國(guó)水產(chǎn);2010年05期

4 黃非;黃秦;黃敏;易秀麗;鄭紅波;喬代蓉;曹毅;;萊茵衣藻玻璃珠法快速轉(zhuǎn)化檢測(cè)體系的建立[J];四川大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2008年03期

5 左石;郭偉;鄒聲泉;;反義MBD1基因片段真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定[J];中華普通外科雜志;2006年04期

6 郭孝,張莉;五寨莜麥在河南引種馴化的研究[J];草與畜雜志;1997年04期

7 趙玉巧,杜云建,熊衛(wèi)東;莜麥方便營(yíng)養(yǎng)粉的研制[J];鄭州輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào);1997年03期

8 劉玲玉 ,倪宗善 ,郭紹川;植物原生質(zhì)體對(duì)逆境反應(yīng)的研究 Ⅰ.蔥、小麥、莜麥原生質(zhì)體對(duì)低溫的反應(yīng)及其與抗寒性的關(guān)系[J];內(nèi)蒙古師院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);1982年02期

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本文編號(hào)：2619901