【摘要】：絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi),在將細(xì)胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞及其核內(nèi),并引起細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng),如細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等的過程中具有至關(guān)重要的作用。TAK1(Transforming growth factor-βactivated kinase-1),又名MAP3K7,作為絲裂源激活蛋白激酶激酶激酶(MAP3K)家族的一員,是MAP3K家族唯一需要接頭蛋白TAB1、2、3的幫助,從而起到激活作用的激酶,能夠通過激活NF-KB、JNK及p38等通路,來(lái)參與免疫應(yīng)答反應(yīng)。文昌魚作為從無(wú)脊椎動(dòng)物進(jìn)化到脊椎動(dòng)物過渡類型的典型代表,成為整個(gè)生物進(jìn)化史上一個(gè)不可缺少的“橋梁”,被譽(yù)為“活化石”。文昌魚具有復(fù)雜的先天免疫系統(tǒng),同時(shí)已有適應(yīng)性免疫的雛形,對(duì)揭示脊椎動(dòng)物免疫的起源具有重要意義。本論文以白氏文昌魚TAK1為研究對(duì)象,對(duì)TAK1基因進(jìn)行克隆,利用生物信息學(xué)方法對(duì)其結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系等進(jìn)行分析,同時(shí)采用qPCR、CoIP等方法進(jìn)一步分析TAK1基因的生物學(xué)功能,得到以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)利用RT-PCR、RACE及End-to-End實(shí)驗(yàn)技術(shù)擴(kuò)增獲得白氏文昌魚TAK1基因全長(zhǎng)序列。TAK1基因全長(zhǎng)為3527bp,其中TAK1-ORF序列長(zhǎng)度為1905bp,編碼634個(gè)氨基酸。(2)生物信息分析的結(jié)果表明:序列比對(duì)及相似性分析顯示白氏文昌魚TAK1蛋白序列與其它物種的同源蛋白序列具有較高的相似性;基因結(jié)構(gòu)分析顯示文昌魚TAK1基因的編碼區(qū)由18個(gè)外顯子和17個(gè)內(nèi)含子組成;保守結(jié)構(gòu)域分析顯示白氏文昌魚TAK1基因包含一個(gè)保守的STKc結(jié)構(gòu)域;系統(tǒng)發(fā)生樹分析結(jié)果表明,白氏文昌魚TAK1位于無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物之間,與經(jīng)典的物種進(jìn)化地位一致;進(jìn)一步的三維結(jié)構(gòu)分析顯示文昌魚與人類的TAK1蛋白在三維結(jié)構(gòu)上具有較高的相似性。(3)對(duì)文昌魚TAK1基因的組織表達(dá)模式分析顯示,TAK1基因在所檢測(cè)的組織,包括性腺、鰓、肝盲囊、腸、肌肉及脊索中均有表達(dá),其中在脊索和性腺中表達(dá)水平相對(duì)較高,而在肌肉和腸中的表達(dá)量相對(duì)較低。對(duì)LPS刺激白氏文昌魚后不同時(shí)間點(diǎn)(2h,4h,6h,8h,12h,24h和48h)TAK1基因的表達(dá)量分析結(jié)果顯示在文昌魚用LPS刺激2h,12h后TAK1基因的表達(dá)量存在顯著上調(diào),在刺激24h后TAK1基因的表達(dá)量逐漸降低。(4)利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建了P3X-FLAG-TAK1表達(dá)載體,通過真核表達(dá)實(shí)驗(yàn),成功表達(dá)出大小為68KDa的特異性蛋白,進(jìn)一步利用Anti-FLAG tag抗體采用Western blot方法初步驗(yàn)證該特異蛋白為重組表達(dá)的TAK1蛋白。為了進(jìn)一步探索文昌魚中TAK1蛋白是否與高等物種中一致通過與TAB1互作來(lái)發(fā)揮功能,我們共轉(zhuǎn)染了P3X-FLAG-TAK1和PCDNA3.1-Myc-TAB1重組質(zhì)粒表達(dá)載體,通過CoIP分析結(jié)果顯示,文昌魚的TAK1蛋白與TAB1蛋白之間存在互作關(guān)系。
【圖文】：

圖 1.1 文昌魚解剖圖Figture 1.1 Dissection of amphioxus生活習(xí)性對(duì)水環(huán)境要求較高，，基本常年棲息在含有潔凈水質(zhì)的沙灘礫，有利于文昌魚把絕大部分身體鉆入沙子里，基本只把出砂礫外，因文昌魚身體兩側(cè)不對(duì)稱，因此一般左側(cè)貼臥

TAK1信號(hào)通路[47]
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q953

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本文編號(hào)：2619833