【摘要】：脂類物質(zhì)在維持有機(jī)體正常生命活動(dòng)中承擔(dān)著重要的生物學(xué)功能。其中三酰甘油(Triacylglycerol,TAG)是植物油脂的主要儲(chǔ)存形式,TAG參與種子萌發(fā)和幼苗發(fā)育、花粉粒發(fā)育、葉片衰老和環(huán)境脅迫反應(yīng)等。此外,TAG不僅是人類日常攝取卡路里的重要來(lái)源,而且還可用于人造黃油及新型清潔燃料(生物柴油)的生產(chǎn)。因此提高油料植物TAG含量成為提高作物品質(zhì)和解決能源供給問題的重要目標(biāo)。甘油二酰�；D(zhuǎn)移酶(DGAT)是TAG生物合成過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵限速酶。在真核生物中,根據(jù)結(jié)構(gòu)和活性的不同已經(jīng)鑒定出四種DGAT,其中DGAT1和DGAT2最為常見,對(duì)其研究也最多。因此表達(dá)不同來(lái)源的DGAT1或DGAT2成為提高植物TAG含量的重要策略。然而,已有報(bào)道指出,表達(dá)一些DGAT2并不能提高植物的TAG含量。同樣,在課題組前期研究中,將來(lái)自解脂耶氏酵母的DGAT2(YlDGAT2)轉(zhuǎn)入棉花并未提高棉花TAG含量,卻改變了轉(zhuǎn)基因棉花中TAG和游離脂肪酸的組成,提高了轉(zhuǎn)基因棉花的生物量和產(chǎn)量,但其機(jī)理尚不清楚。前人研究表明,不同來(lái)源的DGAT2其底物選擇偏好性也多不相同。有報(bào)道指出,YlDGAT2對(duì)飽和脂肪酰輔酶A具有選擇偏好性,而來(lái)自擬南芥的AtDGAT2對(duì)不飽和脂肪酰輔酶A具有選擇偏好性。為了進(jìn)一步探究YlDGAT2在植物生長(zhǎng)過(guò)程中的功能,本研究用組成型啟動(dòng)子S7分別控制YlDGAT2和AtDGAT2在擬南芥中表達(dá)來(lái)評(píng)估不同底物偏好性的DGAT2對(duì)擬南芥生長(zhǎng)的影響。主要結(jié)果如下:1.表達(dá)YlDGAT2提高了毛白楊、煙草和擬南芥的生物量,而超表達(dá)AtDGAT2對(duì)擬南芥的生物量沒有影響為了驗(yàn)證YlDGAT2對(duì)植物生物量的影響,分別在毛白楊、煙草和擬南芥中表達(dá)YlDGAT2。結(jié)果顯示,相較于野生型,轉(zhuǎn)基因毛白楊株系2和株系5的株高分別增加了19%和11%;轉(zhuǎn)基因煙草株系S7-YD-2和S7-YD-10的地上部分生物量分別增加了59%和51%;轉(zhuǎn)基因擬南芥S7-YD-10和S7-YD-15株系的葉面積分別增加了38%和34%,且地上部分生物量分別提高了51%和49%。以上結(jié)果表明,表達(dá)YlDGAT2可以提高植物生物量,也能在其他植物中重演。然而,超表達(dá)AtDGAT2對(duì)擬南芥的生物量并沒有產(chǎn)生明顯影響。2.在釀酒酵母中,YlDGAT2對(duì)飽和脂肪酸有偏好性,而AtDGAT2對(duì)非飽和脂肪酸有偏好性在釀酒酵母中分別表達(dá)YlDGAT2和AtDGAT2,結(jié)果顯示,YlDGAT2和AtDGAT2轉(zhuǎn)基因酵母的TAG含量比對(duì)照分別增加了81%和40%。同時(shí)還發(fā)現(xiàn),YlDGAT2和AtDGAT2轉(zhuǎn)基因酵母的TAG組分發(fā)生了相反的變化。即AtDGAT2轉(zhuǎn)基因酵母TAG中不飽和脂肪酸相對(duì)含量上升,飽和脂肪酸相對(duì)含量下降;而YlDGAT2轉(zhuǎn)基因酵母TAG中飽和脂肪酸相對(duì)含量上升,不飽和脂肪酸相對(duì)含量降低。以上結(jié)果印證了YlDGAT2對(duì)飽和脂肪酸具有選擇偏好性,而AtDGAT2對(duì)不飽和脂肪酸具有選擇偏好性。3.超表達(dá)AtDGAT2顯著提高了擬南芥的TAG含量,而表達(dá)YlDGAT2未能提高擬南芥的TAG含量,且二者的TAG和游離脂肪酸組分產(chǎn)生了相反的變化表達(dá)YlDGAT2提高了轉(zhuǎn)基因植物的生物量,而超表達(dá)AtDGAT2則對(duì)擬南芥的生物量影響不大。為了探究造成這種差異的原因,檢測(cè)了各轉(zhuǎn)化子葉片和種子的TAG含量。結(jié)果顯示,與野生型相比,S7-AtDGAT2轉(zhuǎn)基因擬南芥S7-AD-17和S7-AD-19轉(zhuǎn)化子葉片中TAG含量分別提高了27%和31%,種子中TAG含量分別提高了26%和32%。而表達(dá)YlDGAT2未能提高擬南芥葉片和種子的TAG含量,這和前期S7-YlDGAT2轉(zhuǎn)基因棉花的觀察結(jié)果一致。此外,S7-YlDGAT2轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片TAG中的飽和脂肪酸比例升高,不飽和脂肪酸比例下降;而在游離脂肪酸中,飽和脂肪酸的比例降低,不飽和脂肪酸的比例升高。與此相反,S7-AtDGAT2轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片TAG中的飽和脂肪酸比例降低,不飽和脂肪酸比例升高;而在游離脂肪酸中,飽和脂肪酸比例升高,不飽和脂肪酸比例降低。以上結(jié)果說(shuō)明,YlDGAT2和AtDGAT2的底物偏好性差異導(dǎo)致S7-YlDGAT2和S7-AtDGAT2轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片TAG中的脂肪酸和游離脂肪酸的組成比例發(fā)生了相反的變化。4.表達(dá)YlDGAT2促進(jìn)了擬南芥茉莉酸(JA)的生物合成,而超表達(dá)AtDGAT2擬南芥的JA含量未發(fā)生明顯變化與前期在轉(zhuǎn)基因棉花中結(jié)果一致,表達(dá)YlDGAT2提高了擬南芥亞麻酸含量,上調(diào)了JA生物合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平,進(jìn)而提高了JA的含量。然而,S7-AtDGAT2轉(zhuǎn)基因擬南芥的JA含量未發(fā)生明顯變化。5.表達(dá)YlDGAT2促進(jìn)了棉花和擬南芥?zhèn)雀陌l(fā)育相較于野生型,S7-YlDGAT2轉(zhuǎn)基因擬南芥S7-YD-10和S7-YD-15以及轉(zhuǎn)基因棉花S7-YD-3和S7-YD-4株系的幼苗側(cè)根數(shù)目均顯著增加,而主根長(zhǎng)度明顯變短。JA響應(yīng)因子ERF109能夠交聯(lián)JA信號(hào)和IAA的生物合成。隨著擬南芥中JA含量的提高,ERF109及下游IAA合成相關(guān)基因ASA1轉(zhuǎn)錄水平上調(diào),擬南芥S7-YD-10和S7-YD-15的12 d幼苗根部IAA含量分別提高了37%和32%,表明,JA的適度增加促進(jìn)了IAA在根部的生物合成,進(jìn)而促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因棉花和擬南芥的側(cè)根的發(fā)育。然而S7-AtDGAT2轉(zhuǎn)基因擬南芥根系并未發(fā)生明顯變化,從側(cè)面印證了超量表達(dá)AtDGAT2并未促進(jìn)JA的生物合成。6.表達(dá)YlDGAT2促進(jìn)了T6P和淀粉的合成檢測(cè)結(jié)果顯示,S7-YlDGAT2轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片中的T6P含量上升,淀粉含量增加,而蔗糖含量下降。相反,S7-AtDGAT2轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片中的T6P含量變化不大,但其淀粉的含量和可溶性總糖、蔗糖顯著下降。說(shuō)明表達(dá)YlDGAT2促進(jìn)光合產(chǎn)物流向淀粉合成,減少了向TAG合成的分配,導(dǎo)致油脂含量有所降低。而超量表達(dá)AtDGAT2促進(jìn)了碳源流向TAG合成,同時(shí)減少了向淀粉合成的分配。綜上所述,本研究為揭示DGAT的底物選擇偏好性和JA生物合成之間的聯(lián)系提供了證據(jù),也為提高作物的生物量和產(chǎn)量提供了有效策略。
【圖文】：

類的合成重疊，因?yàn)镻A和DAG也是所有細(xì)胞中主要膜脂的前體。在三種�；D(zhuǎn)移酶中（GPAT、AGPAT和DGAT），只有DGAT專一合成TAG，由于DGAT在植物組織TAG合成途徑中的重要影響使其受到了最廣泛的關(guān)注（圖1.1）（Chapman KD & Ohlrogge JB,2012）。此外許多證據(jù)表明，植物中TAG的合成并不只是通過(guò)GPAT、LPAT和DGAT（中間含有一個(gè)PAP）連續(xù)�；视偷膫鹘y(tǒng)的Kennedy途徑那樣簡(jiǎn)單。近年來(lái)，在植物和酵母中發(fā)現(xiàn)了一種不依賴�；o酶A的�；D(zhuǎn)移酶：磷脂二�；视王；D(zhuǎn)移酶（PDAT）（Dahlqvist Aet al., 2000）。PDAT以磷脂酰膽堿（PC）為�；w，催化DAG合成TAG（St hl et al., 2004; Henry et al., 2012; 譚太龍等，2014）。圖1.1 植物中�；蕾嚭头酋；蕾嘥AG合成途徑（Chapman KD & Ohlrogge JB, 2012）GPAT：甘油-3-磷酸�；D(zhuǎn)移酶；LPAT：溶血磷脂酸�；D(zhuǎn)移酶；PAP：磷脂酸磷酸酶；DGAT：甘油二酰�；D(zhuǎn)移酶；PDAT：磷脂二�；视王；D(zhuǎn)移酶Figure 1.1 Acyl-CoA-dependent and acyl-CoA-independent pathways for TAG biosynthesis in plants(Chapman KD & Ohlrogge JB, 2012)GPAT: glycerol-phosphate acyltransferase; LPAT: lysophosphatidic acid acyltransferase; PAP: phosphatidic acidphosphohydrolase; DGAT: diacylglycerol acyltransferase; PDAT: phospholipid: diacylglycerol acyltransferase.1.2 二�；视王；D(zhuǎn)移酶（DGAT）的研究進(jìn)展1.2.1 DGAT 的種類和功能DGAT（EC 2.3.1.20）是 TAG 從頭合成途徑中的關(guān)鍵酶。不同類別的 DGAT 對(duì)裝載到 TAG 中的�；o酶 A 的種類和數(shù)量有著不同的選擇。在真核生物中

第 1 章 文獻(xiàn)綜述不同已經(jīng)鑒定出四種 DGAT（Sanjaya et al., 2013）。最常見的兩種類型是 DGGAT2，二者都被證明參與了 TAG 的合成（圖 1.2）（Yen et al., 2008）。DGAT1小鼠（Mus musculus）中被發(fā)現(xiàn)，而植物中首先在擬南芥中被鑒定（Cases et al., 19bs et al., 1999; Routaboul, et al., 1999）。據(jù)預(yù)測(cè)，DGAT1 蛋白具有六個(gè)或更多跨域，屬于膜結(jié)合氧-�；D(zhuǎn)移酶家族（Cases et al., 1998）。DGAT2 最先在產(chǎn)脂真被孢霉（Morteriella ramanniana）中被發(fā)現(xiàn)。在結(jié)構(gòu)上，DGAT2 蛋白與 DGAT1僅具有二到三個(gè)預(yù)測(cè)的跨膜結(jié)構(gòu)域（Yen et al., 2008）。第三類 DGAT 來(lái)自包含酶 ADP1 的不動(dòng)桿菌（Acinetobacter calcoaceticus），表現(xiàn)出蠟酯合酶（WS）和 DG（Kalscheuer & Steinbüchel, 2003）。ADP1 同系物已在擬南芥和矮牽牛屬（矮牽交種）中被鑒定出，并表現(xiàn)出不同水平的 WS 和 DGAT 活性（King et al., 2007; L008）。第四類是一種可溶性細(xì)胞溶質(zhì) DGAT 酶（DAGT3），最先在花生中被鑒芥中存在同源基因（Saha et al., 2006; Hernández et al., 2012）。不同 DGAT 酶的好性可能決定了微藻和植物中 TAG 的脂肪酸組成（Sanjaya et al., 2013）。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q943.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 苑麗霞;毛雪;高昌勇;張莉;薛金愛;楊致榮;李潤(rùn)植;;種子特異表達(dá)二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因(VgDGAT1)提高亞麻薺種子油脂積累[J];植物生理學(xué)報(bào);2015年05期

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本文編號(hào)：2616357