【摘要】：小鼠早期胚胎的細(xì)胞極性和世系特征對(duì)后續(xù)發(fā)育至關(guān)重要。然而,在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)/滋養(yǎng)層世系命運(yùn)決定事件中,關(guān)于細(xì)胞極性如何決定世系命運(yùn)的確切信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制仍不清楚。我們從研究極性蛋白PATJ/MPDZ在早期胚胎發(fā)育過程中的作用出發(fā),揭示細(xì)胞極性與世系命運(yùn)決定的關(guān)系。首先,我們運(yùn)用RT-PCR、熒光實(shí)時(shí)定量PCR以及免疫細(xì)胞化學(xué)等技術(shù)方法檢測(cè)CRB極性蛋白復(fù)合體在小鼠植入前胚胎中的表達(dá)定位模式。結(jié)果顯示:CRB3從2-細(xì)胞胚胎開始表達(dá),在8-細(xì)胞胚胎階段表達(dá)量升高,一直持續(xù)到囊胚;PALS1在植入前胚胎的每個(gè)階段都有不同程度的表達(dá),但沒有顯著性差異;PATJ從受精卵到4-細(xì)胞胚胎呈中等水平表達(dá),在8-細(xì)胞胚胎階段表達(dá)量升高,一直持續(xù)到囊胚;MPDZ從致密化8-細(xì)胞胚胎開始表達(dá),并且呈低水平表達(dá)。從蛋白質(zhì)定位上看,CRB極性蛋白復(fù)合體各組分在致密化8-細(xì)胞胚胎之前未呈現(xiàn)極性定位,均勻分布在整個(gè)胚胎的所有卵裂球中;從致密化8-細(xì)胞胚胎開始,CRB極性蛋白復(fù)合體開始出現(xiàn)極性分布,CRB3和PALS1定位在外部細(xì)胞的頂端膜上,PATJ和MPDZ定位在外部細(xì)胞的緊密連接處。這樣的表達(dá)模式提示:CRB極性蛋白復(fù)合體的極性分布可能參與調(diào)控胚胎的世系分化。其次,我們運(yùn)用RNA干擾的方法,特異性的敲減Patj/Mpdz基因的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)單純的敲減Patj基因僅可以從一定程度上抑制囊胚的形成,但是仍有接近一半的胚胎可以正常發(fā)育;同時(shí)敲減Patj/Mpdz基因可以抑制72.7%的胚胎發(fā)育到囊胚,而且即使發(fā)育到囊胚,這些胚胎也不能正常的進(jìn)行滋養(yǎng)層世系分化擴(kuò)張。這些的結(jié)果說明了通過shRNA干擾降低Patj/Mpdz基因的表達(dá)可以有效降低囊胚的形成率。結(jié)果提示:極性蛋白PATJ/MPDZ可能在囊胚形成中起到重要的調(diào)控作用。再次,我們進(jìn)一步研究Patj/Mpdz基因調(diào)控滋養(yǎng)層世系分化的機(jī)制,通過免疫細(xì)胞化學(xué)和細(xì)胞骨架染色的方法,對(duì)CRB極性蛋白復(fù)合體、細(xì)胞骨架、E-鈣粘連蛋白和ZO-1進(jìn)行染色。結(jié)果顯示,敲減Patj/Mpdz基因?qū)е翪RB極性蛋白復(fù)合體、細(xì)胞骨架及ZO-1的定位紊亂,但是不影響E-鈣粘連蛋白的定位。由此可見:敲減Patj/Mpdz基因不影響胚胎的正常致密化,但是破壞了胚胎的頂端-基底側(cè)極性、細(xì)胞骨架以及TJ的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,最終導(dǎo)致囊胚發(fā)育異常。最后,我們探討了Hippo通路在敲減Patj/Mpdz基因抑制囊胚發(fā)育中的作用。我們通過免疫細(xì)胞化學(xué)的方法追蹤YAP的定位情況,用以指示Hippo通路的調(diào)節(jié)狀態(tài)。結(jié)果顯示:敲減Patj/Mpdz基因?qū)е耏AP的定位紊亂,內(nèi)-外部細(xì)胞中的YAP均磷酸化形成p-YAP,致使TE的特異性轉(zhuǎn)錄因子CDX2表達(dá)減弱,最終導(dǎo)致外部細(xì)胞失去滋養(yǎng)層世系的特征。結(jié)果表明:極性蛋白PATJ/MPDZ通過調(diào)控植入前胚胎外部細(xì)胞的Hippo通路來維持TE的形成。綜上所述:極性蛋白PATJ/MPDZ在植入前胚胎中具有穩(wěn)定胚胎極性、細(xì)胞骨架以及緊密連接的作用,并且通過調(diào)節(jié)Hippo通路進(jìn)而調(diào)控胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)/滋養(yǎng)層世系分化。
【圖文】：

第二章 CRB 極性蛋白復(fù)合體在小鼠植入前胚胎中的表達(dá)定位驗(yàn)證。Crb3基因在哺乳動(dòng)物中還有兩個(gè)同系物，即Crb1基因和Crb2基腦和視網(wǎng)膜中表達(dá)（Hollander et al，2002），而Crb2基因在腎，在心臟、肺和胎盤中低水平表達(dá)（Ja et al，2005）。Crb2 mR過程中未被檢測(cè)到，，而Crb1 mRNA只能在受精卵和2細(xì)胞胚胎中入前胚胎中的mRNA水平相當(dāng)?shù)停▓D2-2）。

2-1 CRB極性蛋白復(fù)合體 mRNA在小鼠植入前胚胎中ion of CRB Polarity Protein Complex mRNA in mouse P白復(fù)合體各組分在植入前胚胎典型發(fā)育階段的表達(dá)情況。Zy胞胚胎；c8c：致密化8細(xì)胞胚胎，Mo：桑葚胚；Bl：囊胚；Gf CRB polarity Protein Complex Components by RT-PCR in they: Zygote; 2-c: 2-cell embryo; 4c: 4-cell embryo; 8c: 8-cell emastocyst; Gapdh was employed as loading control. The experimen
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q132

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本文編號(hào)：2615826