【摘要】：捕食線蟲真菌少孢節(jié)叢孢(Arthrobotrys oligospora)產(chǎn)生一類特有的可以調(diào)控菌絲形態(tài)的信號小分子-少孢素類化合物(Arthrosporols)。本課題組前期通過單基因敲除方法,鑒定了位于AOL_s00215g基因簇上參與少孢素類化合物生物合成的9個關(guān)鍵基因283-276和基因274,但對其中的274、280、276、277、278這五個基因的生物合成功能仍未完全解析,本論文通過構(gòu)建雙敲除突變菌株來研究這些生物基因的功能。主要結(jié)果和創(chuàng)新:1、利用潮霉素和氯嘧磺隆為篩選標記,成功構(gòu)建四株少孢節(jié)叢孢雙基因敲除突變菌株Δ280A274、Δ278A277、Δ276A277、Δ259A911。2、雙敲除菌株Δ280A274菌絲形態(tài)與單敲除菌株Δ280更相似,比單敲除菌株A274的菌絲更為茂盛;Δ280Δ274生長速度要比Δ280、Δ274、野生菌株分別慢28.0%、30.3%、30.7%。在24h,Δ280A274捕器數(shù)量比Δ280、A274、野生型菌株分別增加0.2倍、2.5倍、5.7倍。在孢子產(chǎn)量上,A280A274比野生型少98.9%,比A274少99.4%,但是比Δ280的增加2倍。基因280敲除比基因274敲除對菌絲形態(tài)、孢子產(chǎn)量、捕器數(shù)量影響更大,A280A274的菌絲形態(tài)、孢子產(chǎn)量、捕器數(shù)量更接近A280。3、雙敲除菌株A259A911菌絲形態(tài)與單敲除菌株A259更相似,但生長速度比Δ259快6.7%,比單基因敲除菌株A911慢7.3%,比野生菌株慢l17.2%。在孢子產(chǎn)量上,Δ259Δ911比Δ259減少81.2%,比Δ911和野生型菌株均少99%以上。基因259敲除比基因911敲除對菌絲形態(tài)、孢子產(chǎn)量影響更大,A259A911的菌絲形態(tài)、孢子產(chǎn)量更接近Δ259。4、雙敲除菌株A278A277的菌絲形態(tài)與單敲除菌株A278更相似,但是生長速度比A278快5.0%,比單基因敲除菌株A277慢5.6%,比野生型菌株慢7.3%;在孢子產(chǎn)量上,A278A277比A278減少57.4%,比A277和野生型菌株均減少約99%。敲除基因278比敲除基因277對菌絲形態(tài)、孢子產(chǎn)量影響更大,A278A277菌絲形態(tài)、孢子產(chǎn)量更接近Δ278。5、在PDA、TYGA、YMA培養(yǎng)基中,雙基因敲除菌株Δ276Δ277生長速度比單基因敲除菌株A276慢7.8%,在PDA、TYGA培養(yǎng)基中,Δ276Δ277生長速度比Δ277快2.9%。在12h,A276A277捕器數(shù)量比A277增加30.0%,比A276增加4.3%,而此時野生型無成熟的三維菌網(wǎng)。在孢子產(chǎn)量上,A276A277比A276減少16.0%,比野生型菌株減少30.4%,但比Δ277增加17.7%。基因276、基因277敲除對菌絲生長、菌絲形態(tài)、孢子產(chǎn)量有不同程度的影響,因而Δ276A277菌絲生長、孢子產(chǎn)量介于A276和A277之間,菌絲形態(tài)與野生型相似。6、雙敲除菌株Δ280A274發(fā)酵液粗提物的LC-MS的圖譜,在保留時間35.98min出現(xiàn)了[M+H]+343.226310峰,這與少孢素生物合成的關(guān)鍵中間體三元環(huán)氧化合物的343.22632對應(yīng)。同時A280A274與Δ274有4相同的特有峰分別是:275.163[M+H]+(19.34min)、313.20059[M+H]+(20.67min)、343.22638[M+H]+(35.92min)、327.23126[M+H]+(39.47min),與A280有2 個相同的特有峰是243.08742[M+H]+(15.80min)、267.11878[M+H]+(18.38min)�；�259敲除以后代謝圖譜變化很大,大量產(chǎn)物消失,與少孢素生物合成最上游基因283敲除后的變化相似,而菌株Δ911與野生型的代謝圖譜一致,雙敲除菌株Δ259Δ911的代謝圖譜與Δ259與一致。雙敲除菌株Δ277Δ278的代謝圖譜與Δ277一致,且Δ277代謝圖譜中沒有出現(xiàn)含有C15的法尼基雜合小分子,而Δ278中顯示出含有C15的法尼基雜合小分子,表明基因277作用在基因278前面。雙敲除菌株Δ276Δ277的代謝圖譜與Δ276一致,且Δ276代謝圖譜中沒有出現(xiàn)PKS-TPS雜合小分子,以及峰的消失比Δ277更多,表明在少孢素生物合成途徑中基因276作用應(yīng)在基因277前面。本實驗中通過構(gòu)建雙敲除菌株研究功能相似或相關(guān)的兩個基因之間對菌絲生長、菌絲形態(tài)、孢子產(chǎn)量、孢子萌發(fā)、捕器數(shù)量和捕食線蟲能力方面。發(fā)現(xiàn)雙基因敲除菌株在形態(tài)和孢子萌發(fā)、捕器數(shù)量和捕食線蟲能力上更偏向于引起差異變化更大的單基因敲除菌株。
【圖文】：

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【學位授予單位】：云南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q933

【參考文獻】

相關(guān)碩士學位論文 前2條

1 曾志君;少孢節(jié)叢孢中7個生物合成基因?qū)φ婢硇�、捕食及次級代謝影響的初步探究[D];云南大學;2016年

2 徐梓斐;少孢節(jié)叢孢中PKS/TPS雜合生源類化合物生物合成基因的鑒定[D];云南大學;2016年

本文編號：2615655