【摘要】：生物大分子的結(jié)構(gòu)及其動態(tài)變化是一切生命現(xiàn)象的物質(zhì)基礎(chǔ)。在分子水平上對生物大分子結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行研究,闡釋生命現(xiàn)象的本質(zhì),對人類認(rèn)知世界與自身都有重大意義。本論文系統(tǒng)地調(diào)研光鑷技術(shù)研究單分子的不同實驗方案,并針對多種分子生物學(xué)體系進(jìn)行研究,在前人基礎(chǔ)上提出本研究的目的和實驗方法。取得主要研究成果如下:1.建立高精度、高穩(wěn)定的光鑷?yán)靻畏肿訉嶒炑b置。光鑷對位移及外力的測量精度與系統(tǒng)的穩(wěn)定性決定了適合研究的體系。為了提高原光鑷系統(tǒng)的穩(wěn)定性,本研究采取引入探測光以提高測量精度;利用對粘底微球的圖像識別,實現(xiàn)反饋補(bǔ)償系統(tǒng)漂移等多項措施,創(chuàng)造優(yōu)良的系統(tǒng)穩(wěn)定性。為順利完成單分子測量,我們發(fā)展了單分子樣品的制備、分子偶聯(lián)等技術(shù)。2.研究rpoS RNA自抑制莖環(huán)結(jié)構(gòu)。本文利用光鑷對rpoS RNA的自抑制莖環(huán)進(jìn)行拉伸得到了穩(wěn)定重復(fù)的RNA“力-伸展”曲線。通過對RNA“力-伸展”曲線的分析,得到rpoS RNA自抑制莖環(huán)結(jié)構(gòu)被打開的動力學(xué)過程,證實其three-way-junction結(jié)構(gòu),計算了RNA關(guān)鍵核心部分的自由能。實驗發(fā)現(xiàn)鎂離子明顯提高了自抑制莖環(huán)核心部分的結(jié)合強(qiáng)度,由此推測鎂離子會促使RNA結(jié)構(gòu)變得更加緊密并改變莖環(huán)的空間取向。這一結(jié)構(gòu)變化客觀上拉近了D1和D2莖環(huán)之間的距離,方便Hfq蛋白幫助sRNA結(jié)合在SD區(qū)域上,從而解除基因表達(dá)的自抑制。3.研究GSK、Syntelin抑制CENP-E行走機(jī)理。光鑷研究CENP-E行走的動力學(xué)特性,發(fā)現(xiàn)其平均運動速度低于kinesin-1蛋白,行走一段距離后會“休息”片刻。實驗結(jié)果表明GSK阻斷了CENP-E行走時ATP水解為ADP的過程,從而實現(xiàn)對CENP-E行走的抑制。依據(jù)實驗現(xiàn)象,我們推測Syntelin是通過阻礙CENP-E·ADP從微管上解離,從而抑制了CENP-E運動。4.研究CENP-T與CENP-W蛋白間相互作用強(qiáng)度。本文提出了一種將CENP-T或CENP-W連接在DNA手柄一端,再通過手柄另一端偶聯(lián)在微球上的方案。通過這一策略我們測量了CENP-T/W之間的斷裂力,直接從單分子水平上研究磷酸化對CENP-T/W蛋白結(jié)合強(qiáng)度的影響。5.為了實現(xiàn)對流動細(xì)胞的動態(tài)相位成像,本文提出了一種基于單像素的相位成像方法。通過動態(tài)加載不同波矢的平面波采集物體的傅里葉頻譜,借助逆傅里葉變換對物體的振幅與相位分布進(jìn)行重構(gòu)。實驗測試了二值化相位分布與連續(xù)相位分布,均得到良好的重構(gòu)效果。本文建立了高精度、高穩(wěn)定性的光鑷研究生物單分子力學(xué)特性實驗平臺,并通過一系列生物物理交叉問題的研究證實了這一平臺在生命科學(xué)領(lǐng)域的價值。研究取得的結(jié)果在生命科學(xué)基本問題、醫(yī)學(xué)應(yīng)用等方面都具有一定貢獻(xiàn),為使用光鑷進(jìn)行深入的分子生物學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

１．１．２微針－光鑷法逡逑２００８年Ｂｕｓｔａｍａｎｔｅ等人在研究核糖體時使用了微針－光鑷實驗方法＿，方逡逑法如圖１－２邋（ａ）所示。待研宄的分子處于被微針固定的微球與光鑷捕獲的微球逡逑之間，這種方案能在樣品室較深的位置進(jìn)行實驗，避免了樣品室底面引起的偏逡逑差。而且該方法對于微球的固定比粘連在樣品室底面更加牢固，是目前單分子逡逑光鑷領(lǐng)域中常用的做法。逡逑１．１．３雙光鑷與多光鑷法逡逑雙光鑷法也是一種常用的單分子研宄策略。如圖１－２邋（ｂ）所示，待研究分逡逑子兩端的微球使用兩束獨立的光鑷進(jìn)行捕獲，分子上的外力通過控制其中一個逡逑光阱的位置來完成。雙光鑷系統(tǒng)中實驗區(qū)域不僅距離樣品室底面較遠(yuǎn)，同時樣逡逑品室（或微針）機(jī)械漂移不會對實驗帶來影響，兩個光鑷的位置都只與物鏡有逡逑關(guān)，因此無論是拉伸還是恒力模式＾１６］，都能很好地駕馭。逡逑⑷■邐（ｂ）邐ｓｍｗ逡逑ＰＩ邐yU一逡逑W：

（ａ）圖為微納加工的單分子光鑷示意圖。（ｂ）圖為高通量單分子光鑷進(jìn)行ＤＮＡ逡逑拉伸的示意與實驗圖像。逡逑ｎＳＷＡＴ進(jìn)行ＤＮＡ拉伸如圖１－３邋（ｂ）所示，先向樣品室中輸入中間偶聯(lián)有逡逑ＤＮＡ的微球樣品溶液，很多微球被陣列光阱捕獲。然后通入緩沖液，清洗掉中逡逑間沒有連接ＤＮＡ的單個微球與樣品殘余液體，最后通過移動光阱陣列的位置逡逑拉伸微球間的ＤＮＡ分子。這種光鑷設(shè)備一次可以同時進(jìn)行幾十到上百個分子逡逑的拉伸，補(bǔ)充了傳統(tǒng)單分子光鑷中一次只能對一個分子拉伸的不足；ｎＳＷＡＴ的逡逑功率低，能量利用非常高效；特別是這種芯片式的光鑷不存在機(jī)械漂移，非常逡逑穩(wěn)定，該儀器也容易和熒光顯微技術(shù)等相結(jié)合。逡逑１．１．５熒光光鑷逡逑熒光成像是生命科學(xué)研宄中常用的手段，熒光與光鑷的結(jié)合使得研宄中，，逡逑在獲得分子力譜的同時也能得到熒光標(biāo)記分子的位置信息［２２＿２４］。Ｉｓｈｉｉ等人結(jié)合逡逑？邋光鑷、全內(nèi)反射焚光顯微鏡（Ｔｏｔａｌ邋Ｉｎｔｅｒｎａ丨邋Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ邋Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，逡逑ＴＩＲＦ）與熒光顯微鏡研宄了肌球蛋白沿肌動蛋白運動的精細(xì)過程［２５］。光鑷與逡逑４逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q752

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本文編號：2615478