【摘要】：馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是最大的植物RNA病毒屬—馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)的代表種,其基因組編碼兩個(gè)開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF),在自身蛋白酶的作用下切割成11個(gè)成熟蛋白,其中,輔助成分蛋白酶(Helper component proteinase,HCpro)參與病毒的復(fù)制、RNA沉默抑制、蚜蟲傳毒和癥狀形成等重要生命過程。圓柱狀內(nèi)含體蛋白(Cytoplasmic inclusion protein,CI)在病毒侵染的細(xì)胞中形成的風(fēng)輪狀內(nèi)含體是馬鈴薯Y病毒科Potyviridae病毒鑒定的重要特征,同時(shí)參與病毒復(fù)制、細(xì)胞間移動(dòng)和癥狀形成等過程。HCpro與CI參與癥狀形成過程,但具體機(jī)制還不清楚。研究表明HCpro的三維結(jié)構(gòu)與抗性基因的識(shí)別密切相關(guān),暗示HCpro三維結(jié)構(gòu)在病毒癥狀形成過程中具有重要作用。對(duì)CI編碼的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)PVY CI的C端存在真核生物翻譯起始因子eIF4E的潛在結(jié)合基序:YxxxxLΦ基序。為研究HCpro和CI在癥狀形成過程中的作用,本研究在PVY~N605侵染性克隆基礎(chǔ)上,分別將HCpro不同位置插入標(biāo)簽序列,分析HCpro三維結(jié)構(gòu)與癥狀之間的關(guān)系,通過定點(diǎn)突變技術(shù)突變YxxxxLΦ基序中保守位點(diǎn)鑒定該基序在病毒癥狀形成過程中作用。具體結(jié)果如下:(1)HCpro結(jié)構(gòu)變化影響PVY癥狀形成。N端與中心區(qū)域?qū)VY的癥狀形成的影響更大。在PVY~N605侵染性克隆基礎(chǔ)上,將標(biāo)簽序列IDAGGS分別插入HCpro的N端區(qū)域、中心區(qū)域和C端區(qū)域氨基酸S_1S_2、I_(252)V_(253)和L_(313)V_(314),獲得PVY-HCS_1-S_2、PVY-HCI_(252)-V_(253)、PVY-HCL_(313)-V_(314)突變體。通過農(nóng)桿菌浸潤(rùn)的方法將野生型及其突變體病毒接種本氏煙。結(jié)果顯示,所有的突變體均能夠系統(tǒng)侵染本氏煙。接種4天后PVY-HCS_1-S_2突變體能夠移動(dòng)到系統(tǒng)葉片;接種后25天,與PVY野生型病毒相比,接種PVY-HCS_1-S_2突變體引起寄主系統(tǒng)葉片嚴(yán)重皺縮,植株明顯矮化。接種4天后,未能在本氏煙系統(tǒng)葉片檢測(cè)到PVY-HCI_(252)-V_(253)突變體,但接種后25天可在系統(tǒng)葉片觀察到綠色熒光。接種突變體PVY-HCL_(313)-V_(314)25天后本氏煙的癥狀與野生型相比無(wú)顯著差異。(2)在HCpro不同區(qū)域插入標(biāo)簽序列影響HCpro抑制沉默能力。將標(biāo)簽序列IDAGGS分別插入瞬時(shí)表達(dá)載體pCa-35S:HCpro的N端區(qū)域、中心區(qū)域和C端區(qū)域氨基酸S_1S_2、I_(252)V_(253)和L_(313)V_(314),獲得野生型HCpro及突變體HCproS_1-S_2、HCproI_(252)-V_(253)、HCproL_(313)-V_(314)的瞬時(shí)表達(dá)載體。抑制RNA沉默試驗(yàn)結(jié)果顯示,與野生型相比,突變體HCproS_1-S_2抑制RNA沉默能力增強(qiáng),突變體HCproI_(252)-V_(253)抑制RNA沉默能力顯著減弱,突變體HCproL_(313)-V_(314)的抑制RNA沉默能力與野生型相比無(wú)明顯差異,表明HCpro不同區(qū)域的特定結(jié)構(gòu)或序列在抑制RNA沉默過程中具有重要作用。(3)突變CI中YxxxxLΦ基序影響PVY的癥狀形成。將PVY CI中潛在的eIF4E識(shí)別基序YxxxxLΦ基序中保守位點(diǎn)Y、L突變?yōu)锳,獲得PVY-CI_(Y513AL518A)突變體。通過農(nóng)桿菌浸潤(rùn)方法分別接種本氏煙、普通煙,結(jié)果顯示,與野生型相比,PVY-CI_(Y513AL518A)突變體病毒RNA和蛋白積累水平降低,病毒擴(kuò)散能力減弱。(4)未發(fā)現(xiàn)CI中YxxxxLΦ基序與eIF4E互作的充分證據(jù)。已有研究表明YxxxxLΦ基序普遍存在于eIF4E互作蛋白中。構(gòu)建含野生型PVY-CI與及突變體CI_(Y513AL518A)全長(zhǎng)編碼序列,和CI及突變體CI_(Y513AL518A)C端的酵母表達(dá)載體,結(jié)果未發(fā)現(xiàn)CI通過YxxxxLΦ基序與eIF4E、eIF(iso)4E互作證據(jù)。構(gòu)建CI及突變體CI_(Y513AL518A)、eIF4E、eIF(iso)4E的BiFC載體,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CI及突變體CI_(Y513AL518A)均與eIF4E體內(nèi)存在互作。
【圖文】：

1995；Kasschau et al.,1997；Plisson et al.,2003），可以將 HCpro 分為 3 個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域：N 端區(qū)域、中心區(qū)域和 C 端區(qū)域（如圖 1-2）。N 端區(qū)域包含一個(gè)富含半胱氨酸的區(qū)域，該區(qū)域存在 KITC 基序，與 C 端區(qū)域的 PTK 基序共同參與病毒的蚜傳過程（Blanc et al.,1998；Blanc et al., 1997；Peng et al., 1998），N 端區(qū)域還參與病毒基因組的復(fù)制、系統(tǒng)移動(dòng)、病毒癥狀形成等過程（Atreya et al., 1992；Kasschau et al., 1997；Revers et al., 1999；Seo et al., 2011；Yun-Kiam et al., 2009）；中心區(qū)域參與病毒基因組的復(fù)制（IGN 基序）（Kasschau et al., 1997）、RNA 沉默抑制（FRNK 基序）（Varrelmann et al., 2007）和病毒系統(tǒng)侵染（CC/SC 基序）（Cronin et al., 1995），還可以調(diào)控與其它病毒的協(xié)生過程（魯瑞芳等，2001）；C 端具有番木瓜蛋白酶活性，可以催化自身在甘氨酸/甘氨酸處與多聚蛋白的分離（Guo et al., 2011），同時(shí)它還參與病毒的細(xì)胞間移動(dòng)（Carrington et al., 1989b；Varrelmann et al., 2007）和抑制 RNA 沉默的過程（Urcuqui-Inchima et al., 2000；Urcuqui-Inchima et al., 1999）。

YTHS 作用原理如圖 1-3 所示，轉(zhuǎn)錄因子 DNA 結(jié)合區(qū)域（DNA Binding Domai-BD）和轉(zhuǎn)錄因子激活區(qū)域（Activation Domain, DNA-AD），兩個(gè)結(jié)構(gòu)域相互獨(dú)立合于人工合成的 GAL 報(bào)告基因的上游激活序列（upstream activating sequenc ），BD 攜帶誘餌（Bait）蛋白，AD 與獵物（Prey）蛋白相融合。如果與 BD、A的誘餌蛋白與獵物蛋白兩蛋白質(zhì)能夠互作，則會(huì)互相靠近，建立物理聯(lián)系，使 AD合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子活性，激活報(bào)告基因表達(dá)，由此，，蛋白間的互作與否可由報(bào)告表達(dá)與否進(jìn)行體現(xiàn)。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S432.41

【參考文獻(xiàn)】

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1 魯瑞芳,李為民,王海云,郭明,彭學(xué)賢;馬鈴薯Y病毒HC-Pro中心區(qū)域在病毒協(xié)生作用中的主導(dǎo)地位[J];生物工程學(xué)報(bào);2001年03期

本文編號(hào)：2613086