【摘要】：惡性腫瘤作為世界上致死率最高的疾病之一,對人類生命健康造成的威脅日趨嚴(yán)重。為了攻克腫瘤治療難題,世界各國每年在抗腫瘤藥物的研發(fā)上均投入了大量的人力、物力和財力。雖然新研發(fā)的抗腫瘤藥物數(shù)目眾多,但是臨床轉(zhuǎn)化率較低。由于藥物篩選和藥效評估的研究模型目前主要依靠體外腫瘤細(xì)胞二維(2D)培養(yǎng),細(xì)胞2D培養(yǎng)與體內(nèi)復(fù)雜的生理病理環(huán)境相比,具有顯著性差異,從而導(dǎo)致體外研究與臨床試驗結(jié)果出現(xiàn)差異。相較于腫瘤細(xì)胞2D培養(yǎng),三維(3D)腫瘤球更接近真實的體內(nèi)微環(huán)境,能夠還原體內(nèi)生理條件下細(xì)胞與細(xì)胞及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)之間的相互作用,以及實體瘤中的營養(yǎng)物質(zhì)、O_2、pH、代謝廢物和生長因子梯度。因此,3D腫瘤球逐漸成為最具代表性的體外細(xì)胞培養(yǎng)模型之一。目前,國內(nèi)外科學(xué)家們已經(jīng)開發(fā)出了很多行之有效的3D腫瘤球生成和培養(yǎng)方法,例如:懸浮培養(yǎng)法、非粘附表面培養(yǎng)法、懸滴法和微流體法等。然而這些方法均存在吞吐量低、成本高、需要特殊設(shè)備及專業(yè)操作人員等諸多問題,嚴(yán)重制約了3D腫瘤球的簡單、大批量、可控制備。近年來,由于微孔陣列的結(jié)構(gòu)優(yōu)異性,能促進細(xì)胞自發(fā)聚集,實現(xiàn)尺寸均一、大小可控的3D腫瘤球大規(guī)模生成和培養(yǎng),受到了諸多研究者的關(guān)注。微銑削法、氣體膨脹法、表面張力介導(dǎo)法、光刻法等多種方法已經(jīng)成功地應(yīng)用于微孔陣列的制備。然而現(xiàn)有的方法存在需要特定設(shè)備、耗時長等一系列問題,無法實現(xiàn)微孔陣列的簡單可控制備。為了解決上述問題,本研究提出了一種利用商業(yè)化不銹鋼通孔網(wǎng)將微球陣列化后作為模板,簡便、高效制備聚二甲基硅氧烷(PDMS)微孔陣列的方法,并將其應(yīng)用于3D腫瘤球的生成,成功實現(xiàn)了滿足藥物篩選所需HepG2腫瘤球的高通量生成和培養(yǎng)。本實驗開展了微孔陣列制備和尺寸結(jié)構(gòu)調(diào)控、3D腫瘤球生成和培養(yǎng)、3D腫瘤球回收,以及抗腫瘤藥物敏感性檢測四個方面的研究。具體實驗結(jié)果如下:1.基于樹脂微球和不銹鋼通孔陣列,簡單、高效地制備了微球陣列,并以其為模板,成功實現(xiàn)了球腔型微孔陣列和通孔陣列的大規(guī)模制備。研究結(jié)果表明:通過調(diào)節(jié)微球尺寸,能簡單實現(xiàn)300-700μm范圍內(nèi)任意球腔尺寸PDMS微孔陣列的制備;通過控制甩膠速度,能簡單實現(xiàn)微孔開口尺寸及球腔結(jié)構(gòu)的精確控制;通過將微球陣列制備成夾層結(jié)構(gòu),可實現(xiàn)PDMS通孔陣列的制備。本實驗所制備的300、400、500、600、700μm球腔型微孔陣列和通孔陣列,均具有尺寸均一、排列高度有序的特點。2.利用球腔型PDMS微孔陣列,成功實現(xiàn)了不同尺寸HepG2腫瘤球的可控培養(yǎng)。實驗結(jié)果表明:通過改變微孔尺寸,實現(xiàn)了224.2±10.8、320.0±10.8、349.8±11.1、380.1±24.5和410.4±15.4μm 5種尺寸HepG2腫瘤球的簡單、可控、高通量生成和培養(yǎng)。培養(yǎng)3天后,細(xì)胞活力均在92%以上,能夠滿足生物醫(yī)療領(lǐng)域研究的需求。3.利用PDMS通孔陣列,成功制得通孔腫瘤球培養(yǎng)芯片,用于3D腫瘤球培養(yǎng)和低損傷回收。實驗結(jié)果顯示:利用通孔腫瘤球培養(yǎng)芯片成功制備了尺寸均勻的3D腫瘤球;利用倒吹的方法,能夠回收得到細(xì)胞活力高、骨架完整且連接緊密的3D腫瘤球細(xì)胞。4.利用微孔陣列培養(yǎng)的HepG2腫瘤球,進行了抗腫瘤藥物阿霉素(Dox)的藥物敏感性檢測。實驗結(jié)果表明:3D腫瘤球中細(xì)胞的存活率隨藥物濃度的增大而下降,當(dāng)Dox濃度超過半數(shù)致死量(LC50 8.0μg mL~(-1))時,3D腫瘤球的生長受到明顯抑制。因此,本實驗所提出的3D腫瘤球簡單、高效生成和培養(yǎng)方法,有望在抗腫瘤藥物篩選和藥效評估等生物實驗中大規(guī)模推廣應(yīng)用。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q813.11

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本文編號：2613027