【摘要】：干旱是世界農(nóng)業(yè)面臨的主要非生物脅迫之一,全球約25%的農(nóng)業(yè)用地受到干旱脅迫的影響。我國是受干旱影響最嚴重的國家之一,干旱半干旱地區(qū)占國土面積的50.8%,并且主要分布于西北地區(qū)。生長于西北干旱半干旱地區(qū)的荒漠旱生植物在長期的演化過程中形成了獨特的抗旱機制,蘊含著豐富的抗逆基因資源。本課題組對西北荒漠區(qū)植被組成的優(yōu)勢種多漿旱生植物霸王(Zygophyllum xanthoxylum)的研究顯示,其可從有效Na~+含量極低的干旱土壤中吸收大量Na~+,并由質(zhì)膜Na~+/H~+逆向轉(zhuǎn)運蛋白ZxSOS1將根系吸收的大量Na~+長距離上運至葉,通過液泡膜Na~+/H~+逆向轉(zhuǎn)運蛋白ZxNHX1將其區(qū)域化于葉肉細胞的液泡中作為有益的滲透調(diào)節(jié)劑以抵御逆境脅迫,表明霸王體內(nèi)具有獨特的Na~+轉(zhuǎn)運機制。但對于霸王根系如何從含鹽量極低的土壤中吸收大量Na~+、根中Na~+如何被卸載以及上運至葉脈中的Na~+又是如何從質(zhì)外體空間裝載到葉肉細胞,上述過程目前均不清楚。HKT轉(zhuǎn)運蛋白是高等植物細胞質(zhì)膜上介導Na~+內(nèi)流的候選者,并且在維持體內(nèi)Na~+穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用,但其在霸王中的功能尚未被系統(tǒng)和深入地報道。因此,本論文通過對霸王轉(zhuǎn)錄組中HKT家族基因的分析,克隆了霸王HKT轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因,并通過煙草瞬時表達、酵母與爪蟾卵母細胞中的異源表達、qRT-PCR、原位PCR以及在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中的超表達等方法,分析了霸王HKT轉(zhuǎn)運蛋白的功能,取得如下主要結(jié)果:1.霸王轉(zhuǎn)錄組中存在Unigene13502_All等9個可能編碼HKT轉(zhuǎn)運蛋白的Unigenes,其中,編號為Unigene11474_All的Unigene在根中的表達受鹽處理和滲透脅迫的顯著誘導而上調(diào),編號為CL4173.Contig2_All的Unigene在葉中的表達受滲透脅迫影響而下調(diào)。2.基于轉(zhuǎn)錄組分析,以Unigene13502_All的序列為核心序列,克隆到霸王ZxHKT1;1編碼基因的全長cDNA,進化樹分析顯示ZxHKT1;1屬于HKT第一亞族,與冰葉日中花(Mesembryanthemum crystallinum)McHKT1;1的進化關(guān)系較近。煙草瞬時表達顯示ZxHKT1;1定位于質(zhì)膜。ZxHKT1;1在酵母中為Na~+轉(zhuǎn)運蛋白,不介導K~+的吸收;ZxHKT1;1在爪蟾卵母細胞中特異性地轉(zhuǎn)運Na~+,不介導Li~+、K~+、Cs~+和NH_4~+的吸收。ZxHKT1;1主要在根中表達,原位PCR結(jié)果顯示ZxHKT1;1主要在根的木質(zhì)部薄壁細胞中高豐度表達。用35S啟動子驅(qū)動的ZxHKT1;1在擬南芥athkt1;1突變體株系中的表達,無法回補其因AtHKT1;1的缺失導致的鹽敏感表型,而利用AtHKT1;1啟動子組織特異性表達ZxHKT1;1,不僅可回補athkt1;1突變體的鹽敏感表型,也可增強野生型擬南芥的耐鹽性,表明ZxHKT1;1介導根木質(zhì)部汁液中的Na~+卸載到木質(zhì)部薄壁細胞中,且其功能的發(fā)揮具有組織特異性。進一步研究發(fā)現(xiàn),在霸王最適生長的50 mM NaCl處理下,ZxHKT1;1在根中的表達量下降,這有利于將Na~+轉(zhuǎn)運到植株地上部進而區(qū)域化于液泡中發(fā)揮滲透調(diào)節(jié)作用;但在150 mM NaCl的高鹽處理下,ZxHKT1;1在根中的表達量顯著上調(diào),這有助于減少Na~+向植株地上部的轉(zhuǎn)運和過量積累。3.以轉(zhuǎn)錄組中Unigene11474_All的序列為核心序列,克隆了ZxHKT1;2全長cDNA,進化樹分析顯示ZxHKT1;2屬于HKT第一亞族,與桉樹(Eucalyptus camaldulensis)EcHKT1;2的同源性較高。煙草瞬時表達顯示其定位于質(zhì)膜。ZxHKT1;2在酵母和爪蟾卵母細胞中介導Na~+的吸收、不介導K~+的吸收。qRT-PCR結(jié)果表明,ZxHKT1;2主要在根中表達,50和150 mM NaCl能夠誘導其表達量升高,且前者對其誘導程度更高。原位PCR結(jié)果顯示ZxHKT1;2主要在根表皮和皮層細胞中高豐度表達。基于以上結(jié)果,推測ZxHKT1;2介導霸王根系Na~+的吸收。4.以轉(zhuǎn)錄組中CL4173.Contig2_All的序列為核心序列,克隆到ZxHKT1;3轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因的全長cDNA,進化樹分析顯示其屬于HKT第一亞族,與霸王ZxHKT1;2的進化關(guān)系最近。煙草瞬時表達顯示其定位于質(zhì)膜。ZxHKT1;3在酵母中既不介導Na~+的轉(zhuǎn)運,也不介導K~+的吸收;在爪蟾卵母細胞中的異源表達顯示其特異性介導Na~+的吸收,不介導其他一價陽離子的吸收。qRT-PCR結(jié)果表明,ZxHKT1;3主要在霸王葉中表達,在50和150 mM NaCl處理下,其表達量迅速上調(diào),并且150 mM NaCl對其誘導更為強烈。在擬南芥中的GUS染色結(jié)果顯示,ZxHKT1;3于葉中的細脈游離端的維管組織和周圍的葉肉細胞處特異性表達。根據(jù)上述結(jié)果,推測ZxHKT1;3介導霸王葉肉細胞中Na~+的裝載。以上結(jié)果揭示了HKT轉(zhuǎn)運蛋白在多漿旱生植物霸王Na~+吸收與轉(zhuǎn)運中的功能,加深了對霸王體內(nèi)獨特的Na~+轉(zhuǎn)運機制的認識,為優(yōu)良牧草和農(nóng)作物抗逆性的遺傳改良提供理論依據(jù)。
【圖文】：

根據(jù) Compute PI/MW 在線軟件進行分析，推測其分子量為 59.3 kDa，pI 為 9.28；根據(jù) TMHMM 在線軟件對該基因編碼的氨基酸序列進行疏水域分析，發(fā)現(xiàn)其包含 10 個跨膜域(圖 3-3)。運用 MEGA6 構(gòu)建的系統(tǒng)進表明其屬于 HKT 第一亞族(圖 3-4)，參考 Platten 等(2006)和 Hauser 等(名原則，將該基因命名為 ZxHKT1;1。霸王 ZxHKT1;1 與冰葉日esembryanthemum crystallinum) McHKT1;1 和毛果楊 (Populus trichocKT1;1 的進化關(guān)系較近(圖 3-4)。運用 DNAMAN 軟件對不同物種 HKT列進行多重比對，發(fā)現(xiàn)霸王 ZxHKT1;1 與其他高等植物 HKT 轉(zhuǎn)運蛋白成員具有較高的同源性，與冰葉日中花 McHKT1;1 和模式植物擬KT1;1 的同源性分別為 49%和 46% (圖 3-5)。運用 InterProScan 在線軟件KT1;1 包含 4 個 P 環(huán)，具有 4 個 MPM 結(jié)構(gòu)，并且在第一個 P 環(huán)過濾器氨基酸殘基為 Ser，其余三處均為 Gly (圖 3-5)，這符合 HKT 第一亞族Platten 等，2006)。與此同時，由圖 3-5 可看出在決定鹽芥 TsHKT1;2 是轉(zhuǎn)運蛋白的氨基酸位點處(Ali 等，2016)，ZxHKT1;1 的氨基酸殘基均是冬氨酸的天冬酰胺，這與 AtHKT1;1 相同，因此推測其可能是 Na+轉(zhuǎn)運蛋

55圖 3-10 ZxHKT1;1 在爪蟾卵母細胞中的功能分析Fig. 3-10 Functional analysis of ZxHKT1;1 in X. laevis oocytes：(A、B)：注射水、ZxHKT1;1 的 cRNA 的單個爪蟾卵母細胞在含有 20 mM NaCl 和 KCl B液中的電流圖；(C、D)：在分別含有 4、1、8 和 16 mM Na+的 Bath 溶液中，-120 mV下的電流振幅；(E、F)：ZxHKT1;1 的陽離子選擇性，，在分別含有 20 mM Li+、Na+、Ks+和 NH4+的 Bath 溶液中，-60 mV 條件下的電流振幅；(G)：ZxHKT1;1 的時間依賴性及學；(H)：注射 ZxHKT1;1 的爪蟾卵母細胞分別在 0.3 mM K+和不同濃度 Na+(3 和 10 m及 0.3 mM Na+和不同濃度 K+(0.3、3 和 10 mM)的 Bath 溶液中的電壓、電流值。數(shù)值為值±標準差(n=5)。ote: (A, B), Typical whole-cell currents recorded by hyperpolarized pulses from the oocynjected with water or oocytes expressing ZxHKT1;1 perfused with the bath solution contain0 mM NaCl and KCl. (C, D), Steady-state current amplitudes were recorded at -120 mV in ath solution containing 4, 1, 8, and 16 mM Na+. (E, F), Cation selectivity of ZxHKT1teady-state current amplitudes were recorded at -60 mV in the bath solution containing 20 mi+, Na+, K+, Cs+and NH4+respectively. (G), Time dependency and activation kinetics in urrents generated by ZxHKT1;1. (H), Oocytes expressing ZxHKT1;1 were voltage-clamped
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q943.2


本文編號：2612133