【摘要】：工業(yè)生物技術(shù)一直試圖尋找能夠長(zhǎng)久保持酶活力,并能使其循環(huán)使用的方法。酶的固定化可以滿足以上的要求,但想要獲得高性能的固定化酶通常需要考慮兩點(diǎn):即選擇合適的固定化方法和尋找合適的固定化材料�；谝陨蟽牲c(diǎn)考慮,本研究提出一種基于蛋白質(zhì)納米膠囊的新型酶固定化方式——雙固定化法。首先采用原位自由基聚合技術(shù)在酶分子的表面構(gòu)建聚合物外殼,形成蛋白質(zhì)納米膠囊,然后,蛋白質(zhì)納米膠囊與氧化石墨烯(GO)自組裝形成雙固定化酶。在這里,我們以有機(jī)磷水解酶(OPH)為酶模型,制備了有機(jī)磷水解酶酶納米膠囊(nOPH10),再將OPH和nOPH10分別固定于GO上,形成傳統(tǒng)固定化酶(OPH@GO)和雙固定化酶(nOPH10@GO),并系統(tǒng)研究了固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)、催化性能與組裝機(jī)理,然后基于該雙固定化酶開發(fā)了有機(jī)磷農(nóng)藥(OPs)檢測(cè)生物傳感器。通過(guò)兩步法完成了酶納米膠囊的合成,先對(duì)酶表面丙烯�；幚�,再膠囊化反應(yīng)得到納米膠囊。以相對(duì)酶活為優(yōu)化指標(biāo),通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)探索制備nOPHs的最佳工藝條件,最終得到nOPH10的相對(duì)酶活為97.3%。采用掃描電子顯微鏡(TEM)、原子力顯微鏡(AFM)、聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和動(dòng)態(tài)光散射儀(DLS)等多種表征手段研究了 nOPH10的物化性質(zhì)。與原酶OPH相比,nOPH10的粒徑增加,表面帶電量和電荷性質(zhì)發(fā)生變化,并表現(xiàn)出明顯不同的電泳特征。綜合上述結(jié)果確認(rèn)得到的酶納米膠囊具有“殼-核”結(jié)構(gòu)。采用改進(jìn)的Hummers法制備GO作為固定化載體。在非共價(jià)作用力下,GO分別與OPH和nOPH1O自組裝形成了 OPH@GO和nOPH10@GO。采用AFM、DLS、激光共聚焦顯微鏡(CLSM)和圓二色光譜(CD)等研究了固定化酶的形貌與結(jié)構(gòu),確認(rèn)成功地構(gòu)建了雙固定化酶體系。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)nOPH10在GO上的固載效率要高于OPH的固載效率。機(jī)理研究表明nOPH10與GO之間主要是靜電力和氫鍵協(xié)同作用,而OPH與GO之間主要是疏水作用力。研究了固定化酶的酶學(xué)參數(shù)、催化性能與穩(wěn)定性。與OPH相比,OPH@GO的酶活降低,米氏常數(shù)(Km)和催化常數(shù)(kcat)均升高,二者比值kcat/Km降低,而nOPH10@GO的上述指標(biāo)均升高。熱穩(wěn)定性nOPH10@GOOPH@GOOPH;OPH,OPH@GO和nOPH10@GO維持90%以上相對(duì)酶活的pH范圍分別為7.6～8.7,7.2～9.0和6.5～9.2;體積分?jǐn)?shù)為20%的甲醇中,nOPH10@GO的酶活(60%)分別是OPH(20.3%)和OPH@GO(22.0%)的近三倍;nOPH10@GO凍融循環(huán)五次保留75%相對(duì)酶活,儲(chǔ)存30天酶活未顯著降低,循環(huán)使用10次保留90%以上酶活,均要優(yōu)于OPH和OPH@GO�；贠PH@GO和nOPH10@GO分別構(gòu)建OPs檢測(cè)生物傳感器OPH@GO/GCE和nOPH10@GO/GCE。以氧化峰值電流為優(yōu)化指標(biāo),得到最優(yōu)的固定化酶用量為6 μμL,Nafion溶液的用量為6μL。SEM表征發(fā)現(xiàn)OPH@GO/GCE和nOPH10@GO/GCE的表面粗糙且有許多通道。EIS測(cè)定顯示,滴加固定化酶修飾后,電極的阻抗增加。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)OPH@GO/GCE和nOPH10@GO/GCE表面的傳質(zhì)類型均為擴(kuò)散控制,且前者的響應(yīng)電流、pH適應(yīng)性、精密度、重現(xiàn)性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性均高于OPH@GO/GCE。這和使用不同類型的固定化酶自身催化性能和適應(yīng)性能有關(guān)。
【圖文】：

同時(shí)擴(kuò)大酶的應(yīng)用領(lǐng)域。迄今為止，酶的固定化方法己經(jīng)多達(dá)上百種，然而沒(méi)有一逡逑種技術(shù)可以適用于所用酶的周定化［１２；１３］。這是因?yàn)椴煌膽?yīng)用場(chǎng)合和目的，需要采用不逡逑同的固定化策略。如圖１－１所示，常見(jiàn)的酶固定化策略可以分為：交聯(lián)法、包埋法以及逡逑酶與載體結(jié)合法［１４］。其中，酶與載體結(jié)含法又可根據(jù)二者之間的作用方式不同分為共價(jià)逡逑結(jié)合和非共價(jià)結(jié)合。每種酶固定化方法都有自ａ的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，因而，尋找一種合適的逡逑固定化方法是構(gòu)建高性能梒定化酶的重要步驟之一。此外，想要達(dá)到酶活＿收率高、穩(wěn)逡逑定性好、制備ｆ藝簡(jiǎn)單的直的，固定化材料的選擇也？常童要［１５，１６］。通常根據(jù)材料自身逡逑的性質(zhì)，可以將其分為有機(jī)固定化載體和無(wú)機(jī)固定化載體。逡逑，公灄？、逡逑交聯(lián)法邐包埋法逡逑、非共價(jià)結(jié)合酶與載體結(jié)栜共價(jià)結(jié)合ｙ逡逑圖１－１酶的常見(jiàn)周定化方法逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｓｏｍｅ邋ｃｏｍｍｏｎ邋ｍｅｔｈｏｄｓ邋ｆｏｒ邋ｅｎｚｙｍｅ邋ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ逡逑１．２．１固定化方法及原理逡逑１．２．１．１交聯(lián)法逡逑交聯(lián)法是指采用雙功能試劑將酶分子交聯(lián)在一起，形成酶聚集體以達(dá)到固定化的目逡逑的。交聯(lián)后形成的酶聚集體粒徑一般在１－１００邋ｐｍ

包埋法是借助物理方法或者化學(xué)方法將酶分子限定于載體的內(nèi)部空間或通道中而逡逑實(shí)現(xiàn)酶的固定化［１６，２８］。常見(jiàn)的包埋載體包括有機(jī)高分子聚合物，硅溶膠－凝膠、孔狀纖維逡逑和微膠囊等［２９］。圖１－３為采用硅溶膠－凝膠法制備固定化酶的工藝［３（３］。通過(guò)包埋法制備逡逑的固定化酶可以最大限度的保持酶的活力，這是因?yàn)榘穹ū苊饬嗣概c載體的直接作用，逡逑使得酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)在制備過(guò)程中保持完整《糌益于包埋法上述的優(yōu)點(diǎn)：，關(guān)于采用包埋法逡逑Ｍ定化酶的文獻(xiàn)報(bào)道．層出不窮＾Ｓｈａｐｏｖａｌｏｖａ等人［３１］采用溶膠－凝膠氧化鋁包埋碳酸酐酶、逡逑酸性磷酸酶和辣根過(guò)氧化物酶，發(fā)現(xiàn)包埋之后，酶的紫外線穩(wěn)定性增加。Ｆａｔｈａｌｉ等人Ｐ２］逡逑研究了包埋－交聯(lián)結(jié)合法固定化漆酶，并成功應(yīng)用于催化脫除苯酚。Ｏｌｉｖｅｉｒａ等人［３３］測(cè)試逡逑了海藻酸鹽包埋固定化果膠酶的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)參數(shù)，發(fā)現(xiàn)隨著溫度的增加，原酶和固逡逑定化酶的一階熱變性常數(shù)均增加。雖然包埋法擁有很多優(yōu)點(diǎn)，，但該方法也存在嚴(yán)童的缺逡逑３逡逑
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q814.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2608929