【摘要】：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞中重要的細(xì)胞器,負(fù)責(zé)分泌蛋白和跨膜蛋白的合成、翻譯后修飾及轉(zhuǎn)運等過程,還是細(xì)胞內(nèi)脂類合成及鈣離子儲存的場所。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白累積時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能將會受到影響從而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,激活三條經(jīng)典的信號通路。這三條信號通路分別由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的應(yīng)激感受器IRE1、PERK和ATF6所介導(dǎo),也被統(tǒng)稱為未折疊蛋白反應(yīng)。未折疊蛋白反應(yīng)旨在恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài),但不可逆的應(yīng)激條件下未折疊蛋白反應(yīng)會激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡通路,清除機體中嚴(yán)重受損的細(xì)胞。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與諸多重大疾病密切相關(guān),包括神經(jīng)退行性疾病和腫瘤。然而,未折疊蛋白反應(yīng)決定細(xì)胞命運的詳細(xì)機制并不十分清楚。蛋白激酶D(Protein Kinase D,PKD)家族是一個絲/蘇氨酸激酶家族,且屬于鈣調(diào)蛋白激酶大家族,一共包括三個成員PKD1、PKD2和PKD3。PKD廣泛參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和分泌等過程,與心肌病和腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。有報道表明,氧化應(yīng)激條件下,PKD1被激活進而保護細(xì)胞免于氧化應(yīng)激引發(fā)的凋亡過程�？紤]到氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的緊密關(guān)系,且沒有報道明確顯示PKD在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中的作用�；诖�,本論文針對PKD1與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的相關(guān)性進行了研究,同時探究了非ATP競爭型PKD抑制劑的作用模型。首先,在人肝癌細(xì)胞HepG2和前列腺癌細(xì)胞PC-3中我們發(fā)現(xiàn),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激經(jīng)由PLC/PKCδ通路激活PKD1。通過蛋白免疫印跡、TUNEL和MTT等實驗方法我們發(fā)現(xiàn),PKD1表達沉默或活性抑制能明顯增加細(xì)胞對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的敏感性,表現(xiàn)為caspase-3和PARP剪切及細(xì)胞凋亡率顯著增加。進一步研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下PKD1能夠特異性調(diào)控IRE1信號通路。PKD1表達沉默或活性抑制可選擇性下調(diào)IRE1的蛋白水平,該效應(yīng)與IRE1轉(zhuǎn)錄和翻譯過程無關(guān)。而蛋白酶體抑制劑MG132能夠逆轉(zhuǎn)PKD活性受阻所介導(dǎo)的IRE1蛋白水平降低的效應(yīng),表明PKD1參與調(diào)控IRE1蛋白的穩(wěn)定性。PKD1通過促進IRE1蛋白的穩(wěn)定增強內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所引發(fā)的IRE1/XBP1信號通路的激活。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下,高表達IRE1或XBP1s能夠下調(diào)PKD活性抑制所介導(dǎo)的促細(xì)胞凋亡效應(yīng),表明PKD1通過IRE1/XBP1通路促進細(xì)胞對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的耐受能力。此外,PKD1還可通過上調(diào)MKP1的磷酸化影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下IRE1/JNK信號通路的活化模式。當(dāng)抑制PKD1的表達或活性時,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促MKP1磷酸化的效應(yīng)降低,導(dǎo)致JNK的激活模式由瞬時型激活轉(zhuǎn)變?yōu)殚L時程的強激活。抑制MKP1活性同樣增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡比率。由此可知,PKD1通過兩種方式保護細(xì)胞免受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡:一是維持IRE1蛋白穩(wěn)定,通過促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所介導(dǎo)的IRE1/XBP1通路活性確保該通路的細(xì)胞保護效應(yīng);二是通過MKP1抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下促細(xì)胞凋亡的IRE1/JNK信號通路。研究證實,PKD與心肌病和腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),靶向PKD的藥物研發(fā)一直備受關(guān)注。通過篩選或修飾得到的PKD抑制劑已達幾十種,但其激酶域介導(dǎo)抑制劑結(jié)合的氨基酸殘基并未揭示�；诖�,我們通過同源建模、分子對接和定點突變等方法研究了兩種PKD非ATP競爭性抑制劑kb-NB 142-70(縮寫為kb)和CID755673(縮寫為CID)的作用模式。結(jié)果表明,PKD激酶區(qū)的Leu~(662),Leu~(713)以及Phe~(728)是介導(dǎo)兩種抑制劑結(jié)合的關(guān)鍵位點;同時,抑制劑與PKD之間的穩(wěn)定作用依賴于ATP在激酶活性位點的結(jié)合。激酶域的Leu~(662),Leu~(713)和Phe~(728)通過疏水相互作用影響抑制劑的作用效果。激酶活性口袋下方的Cys~(726)突變?yōu)楸彼峥娠@著降低kb的抑制效果,但對CID的沒有影響。我們推測,與活性位點Cys~(726)的特異性作用可能是kb的抑制活性高于CID的分子基礎(chǔ)。我們的研究結(jié)果證實了PKD1是IRE1功能的一個重要調(diào)控因子,能夠特異性增強內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下IRE1信號通路的促細(xì)胞生存的作用,同時抑制其促細(xì)胞凋亡的效應(yīng)。表明PKD1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激決定細(xì)胞生死命運的過程中起到了關(guān)鍵作用,這有助于進一步闡明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機制及其引發(fā)的生理病理效應(yīng)。同時,我們揭示了PKD活性口袋中介導(dǎo)非ATP競爭性抑制劑結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基。成功構(gòu)建的非ATP競爭性抑制劑的作用模型將為新的高效PKD抑制劑的合理設(shè)計提供有力的指導(dǎo)。
【圖文】：

2圖 1.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡的發(fā)生。（A）未折疊蛋白反應(yīng)壓力感受器，IRE1 、PERK 和 ATF6，傳遞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊狀態(tài)信息到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中從而恢復(fù)其蛋白折疊的能力[13]。（B）當(dāng)細(xì)胞遭受長時間高強度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，PERK 和 IRE1 引起多種信號輸出從而導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙、炎癥小體的活化以及凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體之間通過轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后修飾的 BLC-2 家族蛋白進行相互作用的過程是調(diào)控凋亡的關(guān)鍵步驟。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子的釋放、加劇的蛋白質(zhì)合成以及活性氧的產(chǎn)生都是引起凋亡發(fā)生的因素[15]。Figure 1.1 Endoplasmic reticulum induces the unfolded protein response and cell apoptosis.(A) The unfolded protein response (UPR) stress sensors, inositol-requiring protein 1 (IRE1 ), proteinkinase R-like endoplasmic reticulum (ER) kinase (PERK) and activating transcription factor 6 (ATF6),transduce information about the folding status of the ER to the cytosol and nucleus to restoreprotein-folding capacity[13]. (B) When exposed to chronically high levels of ER stress, PERK andIRE1 both drive multiple signaling outputs that lead to cell dysfunction, activation of the

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文的 PKC 家族成員（包括 PKC 、PKC 、PKCη、PKCθ）能夠直接磷酸化 PKD1 激酶區(qū)域保守的絲氨酸位點[128]。雖然在 PKD1 的激活有一個明顯的膜定位過程，但該過程并非是其激活所必須的[129]，而調(diào)節(jié)區(qū)域和激酶區(qū)域的解離才是引起 PKD1 激活的關(guān)鍵過程。因此，PKD1 調(diào)節(jié)區(qū)域 CRD 的缺失、PH domain 上特定位點突變或磷酸化[130,131]以及酸性區(qū)域上半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3（caspase-3）剪切位點被剪切[132]都能夠?qū)е?PKD1 活性的增加，，所有這些過程都導(dǎo)致了 PKD1 調(diào)節(jié)區(qū)域和激酶區(qū)域的解離。此外，PKD1 的 PH domain 還負(fù)責(zé)激活過程中 PKD1 與膜上的脂類及其它蛋白的結(jié)合，該結(jié)合有利于 PKD1 及 PKD1 下游底物的激活[133,134]。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q244

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本文編號：2604831