【摘要】：蝦青素(astaxanthin,3,3'-二羥基-4,4'-二酮基-β,β'-胡蘿卜素,C_(40)H_(52)O_4)是一種次生類胡蘿卜素,具有抗氧化、增強機體免疫力、抗癌、著色等作用,在食品及保健品、藥品、飼料工業(yè)、化妝品等方面有著廣泛的應(yīng)用。蝦青素主要是在藻源(雨生紅球藻)、紅發(fā)夫酵母及人工合成中通過各種方法進行合成。不同來源的蝦青素結(jié)構(gòu)不同。含蝦青素的藻源主要為雨生紅球藻。來自雨生紅球藻的蝦青素的結(jié)構(gòu)是3S,3'S,屬于100%的左旋結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,人或動物攝入體內(nèi)后才能發(fā)揮一些重要的保護功能,最大程度上發(fā)揮其應(yīng)有的多種生物功效。紅發(fā)夫酵母中蝦青素為3R,3'R,屬于右旋,而人工合成蝦青素含3S,3'S、3S,3'R、3R,3'R。在這3種蝦青素結(jié)構(gòu)中,左旋的抗氧化性最強,只有雨生紅球藻能夠通過生物合成途徑合成。雨生紅球藻在多種逆境脅迫條件下能夠迅速合成并大量積累天然蝦青素,其含量最高可達細胞干重的5%。因此,它是目前公認的合成天然蝦青素的首選工具,但利用雨生紅球藻大規(guī)模生產(chǎn)蝦青素仍然是一個挑戰(zhàn),具有以下問題:生長周期長、生長速度慢、藻密度較低、占地面積廣,而且易受到細菌和雜藻污染。為了提供另一種蝦青素可用的來源,將集胞藻PCC6803用作底盤細胞,延伸類胡蘿卜素生物合成途徑以生產(chǎn)蝦青素。集胞藻PCC6803具有培養(yǎng)條件較簡單、生長速度較快、不會產(chǎn)生毒素、細胞結(jié)構(gòu)較簡單、遺傳背景較清楚、方便于分子操作等有利于在光合生物反應(yīng)器進行大規(guī)模生產(chǎn)的條件,是理想的藍藻基因工程的受體。集胞藻PCC6803能夠合成蝦青素的上游底物海膽酮和玉米黃質(zhì),和雨生紅球藻相比,缺乏合成蝦青素的關(guān)鍵酶β-胡蘿卜素酮化酶(BKT)和類胡蘿卜素羥化酶(CRTR-B),不能將海膽酮和玉米黃質(zhì)進一步轉(zhuǎn)化為蝦青素。將來自雨生紅球藻的β-胡蘿卜素酮化酶基因(bkt)和類胡蘿卜素羥化酶基因(crtR-B)根據(jù)集胞藻PCC6803的密碼子偏好性進行了密碼子優(yōu)化,然后在集胞藻PCC6803中進行異源表達,之后通過基因組PCR,Southern blot,RT-PCR,Western blot驗證bkt和crtR-B基因的表達,高效液相色譜檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入bkt和crtR-B基因的突變株中產(chǎn)生了蝦青素,蝦青素的總量為0.68±0.01 mg/g(干重)。之后通過脅迫提高蝦青素的產(chǎn)量,發(fā)現(xiàn)集胞藻PCC6803突變株在10%NaNO_3脅迫14天后蝦青素總量達到4.81±0.06 mg/g(DW)。且游離蝦青素占總蝦青素的比例為30%以上,3S,3'S蝦青素占總蝦青素的比例為82.61%。這些結(jié)果證明了集胞藻PCC6803用于代謝工程生產(chǎn)蝦青素的可用性和行業(yè)應(yīng)用潛力。
【圖文】：

第 1 章 引言 集胞藻 PCC6803 的類胡蘿卜素合成途徑在集胞藻 PCC6803 中，合成類胡蘿卜素的途徑(圖 1.3)和雨生紅球藻中蘿卜素的途徑相同，都是先通過非甲羥戊酸途徑中合成異戊烯焦磷酸(異戊二烯途徑合成類胡蘿卜素的關(guān)鍵物質(zhì)[48]。在集胞藻 PCC6803 中，胡蘿卜素均通過類異戊二烯化合物合成途徑合成，異戊烯焦磷酸( IPP)的前體物質(zhì)，異戊烯焦磷酸(IPP)經(jīng)一步步催化生成 β-胡蘿卜素，β-環(huán)rtR) 催化 β-胡蘿卜素，使其經(jīng)過羥基作用化生成 β-隱黃素，最終生成。β-胡蘿卜素在 β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)酮酶(crtO/crtW)催化下向海膽酮轉(zhuǎn)化。

第 2 章 產(chǎn)蝦青素集胞藻 PCC6803 的構(gòu)建接下來，根據(jù)集胞藻 PCC6803 的密碼子偏好性，由 GenScript 公司(中國)優(yōu)化了 882bp crtR-B (GenBank：AF162276.1) 基因的密碼子。以集胞藻 PCC6803基因組為模板擴增 PpsbA2啟動子片段。然后使用融合 PCR 將 PpsbA2片段和 crtR-B 片段融合在一起，并插入到 p5ST1T2 質(zhì)粒的 EcoRI 和 SalI 位點之間，經(jīng)抗性篩選后提取質(zhì)粒，將含 crtR-B 目的片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入至集胞藻 PCC6803 野生株中，經(jīng)連續(xù)抗性篩選直至 crtR-B 基因完全轉(zhuǎn)入的突突株。crtR-B-p5ST1T2 載體構(gòu)建示意圖如圖 2.1b 所示。上面使用的引物列于表 2.3 中。
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q813

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