赭曲霉毒素A（Ochratoxin A,OTA）主要是由曲霉和青霉產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物,主要污染糧谷類、咖啡、中草藥、葡萄及葡萄酒等農(nóng)作物及食品。研究表明,OTA對人類及動物都具有肝腎毒性、致癌和致突變等作用,是目前對人類及動物最具威脅的真菌毒素之一。因此,對OTA建立高靈敏度、快速簡便的檢測方法意義重大。本研究從兩個方向著手,致力于提高檢測方法的靈敏度。一是結(jié)合新型信號放大方式構(gòu)建檢測OTA的酶促免疫傳感方法;二是對抗OTA納米抗體進行體外親和成熟,提高納米抗體的親和力。主要研究如下:1. 鈣黃綠素可與Ce³⁺結(jié)合形成絡(luò)合物,其熒光發(fā)生猝滅;當(dāng)Ce³⁺與PO₄^3-結(jié)合產(chǎn)生Ce PO₄時,鈣黃綠素從絡(luò)合物中解離,其熒光發(fā)生復(fù)性。利用鈣黃綠素與PO₄^3-競爭結(jié)合Ce³⁺的原理,構(gòu)建磷酸鹽觸發(fā)熒光免疫傳感系統(tǒng)。通過優(yōu)化免疫傳感系統(tǒng)中各參數(shù),如抗原濃度、抗體濃度、甲醇濃度、競爭反應(yīng)時間、p H值和離子強度,建立了基于納米抗...

【文章頁數(shù)】：90 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 OTA的研究進展
        1.1.1 OTA的結(jié)構(gòu)及其理化性質(zhì)
        1.1.2 OTA的毒性作用和限量標(biāo)準(zhǔn)
        1.1.3 OTA的檢測方法
    1.2 納米抗體的研究進展
        1.2.1 納米抗體的來源
        1.2.2 納米抗體的特性
        1.2.3 納米抗體在分析檢測中的應(yīng)用
    1.3 基因工程抗體體外親和成熟的研究進展
        1.3.1 抗體庫展示技術(shù)
        1.3.2 基因工程抗體體外親和成熟方法
    1.4 論文研究的目的意義和內(nèi)容
        1.4.1 本文研究的主要內(nèi)容
        1.4.2 本文研究的目的及意義
        1.4.3 創(chuàng)新點
2 基于Nb-AP檢測赭曲霉毒素A的磷酸鹽觸發(fā)熒光免疫分析法
    2.1 材料、儀器與試劑
        2.1.1 主要材料
        2.1.2 主要試劑及培養(yǎng)基
        2.1.3 主要儀器與設(shè)備
    2.2 方法與步驟
        2.2.1 Nb28-AP的誘導(dǎo)表達、純化及鑒定
        2.2.2 Nb-AP介導(dǎo)的磷酸鹽觸發(fā)熒光免疫分析法的構(gòu)建
        2.2.3 Nb28-AP介導(dǎo)的磷酸鹽觸發(fā)熒光免疫分析法的構(gòu)建
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 Nb28-AP的誘導(dǎo)表達、純化及鑒定
        2.3.2 磷酸鹽觸發(fā)熒光傳感系統(tǒng)的構(gòu)建
        2.3.3 Nb-AP介導(dǎo)的磷酸鹽觸發(fā)熒光免疫分析法(PT-FIA)的構(gòu)建
    2.4 小結(jié)
3 納米抗體Nb28的分子模擬及丙氨酸掃描
    3.1 材料、儀器與試劑
        3.1.1 主要材料
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要儀器與設(shè)備
        3.1.4 丙氨酸掃描突變引物
    3.2 方法與步驟
        3.2.1 SWISS-MODEL建模
        3.2.2 Nb28與OTA分子對接
        3.2.3 丙氨酸掃描突變
        3.2.4 突變子的表達與純化
        3.2.5 突變子的活性分析
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 SWISS-MODEL建模
        3.3.2 Nb28與Nb28與OTA的分子對接
        3.3.3 丙氨酸掃描突變
        3.3.4 突變子的活性分析
    3.4 小結(jié)
4 納米抗體Nb28體外親和成熟
    4.1 材料、儀器與試劑
        4.1.1 主要材料
        4.1.2 主要試劑及培養(yǎng)基
        4.1.3 主要儀器與設(shè)備
        4.1.4 突變引物
    4.2 方法與步驟
        4.2.1 pHEN1-28的雙位點隨機突變
        4.2.2 隨機突變文庫的構(gòu)建
        4.2.3 飽和突變文庫的救援
        4.2.4 抗OTA納米抗體的淘選
        4.2.5 突變子活性分析
        4.2.6 表達載體構(gòu)建
        4.2.7 Nb-G53Q&S102D的表達及活性分析
        4.2.8 Nb-G53Q&S102D親和力測定
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 pHEN1-28的雙位點隨機突變
        4.3.2 文庫的質(zhì)量評估
        4.3.3 抗OTA納米抗體的淘選與鑒定
        4.3.4 突變子活性分析
        4.3.5 Nb-G53Q&S102D的活性分析
        4.3.6 Nb-G53Q&S102D親和力測定
    4.4 小結(jié)
5 結(jié)論
參考文獻
附錄 碩士期間發(fā)表論文
致謝



本文編號：4043759