黃曲霉毒素B₁(AFB₁)分布廣泛,可以致癌、致畸和致突變,且在食品中檢出率較高,嚴重威脅人類和動物的健康。酶聯免疫分析技術和膠體金免疫層析技術因其特異性強、高通量、簡單快速、低成本等優(yōu)點成為檢測黃曲霉毒素的常用方法之一。然而,隨著人們對食品安全和質量的要求越來越嚴格,這兩種免疫學分析方法由于其檢測靈敏度偏低的局限性,已經無法滿足某些實際應用的需求。因此如何提高這兩大免疫學檢測方法的靈敏度已成為當前亟待解決的主要問題。駝源性納米抗體作為目前體積最小的基因工程抗體,具有穩(wěn)定性高、生產周期短、產量高,易于遺傳信息改造、成本低等優(yōu)點,已經被廣泛應用于食品安全檢測等領域。為了提高酶聯免疫分析技術和膠體金免疫層析技術的檢測靈敏度,本文以駝源性納米抗體為主要實驗材料,緊緊圍繞著提高檢測信號的靈敏度和改進免疫學元件親和力兩個策略進行了如下研究:1生物素化納米抗體的制備及應用的研究(策略一:提高檢測信號的靈敏度)通過化學生物素法和酶催化生物素法標記納米抗體,得到了三種生物素化納米抗體,即G8-L-Biotin(長臂)、G8-S-Biotin(短臂)和G8-B...

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【學位級別】：博士

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摘要
ABSTRACT
縮略語
第1章 引言
    1.1 黃曲霉毒素B₁的研究進展
        1.1.1 黃曲霉毒素B
        1.1.2 AFB₁ 的限量標準
        1.1.3 AFB₁ 免疫學檢測方法的研究進展
    1.2 納米抗體技術研究進展
        1.2.1 納米抗體的特點
        1.2.2 納米抗體在小分子化合物檢測中的應用
        1.2.3 納米抗體的進化
    1.3 主要研究內容和意義
        1.3.1 研究內容
        1.3.2 研究意義
第2章 基于抗AFB₁生物素化納米抗體融合蛋白的研究
    2.1 材料、儀器與試劑
        2.1.1 主要材料
        2.1.2 主要儀器
        2.1.3 主要溶液和培養(yǎng)基
    2.2 方法與步驟
        2.2.1 化學生物素標記法
        2.2.2 表達載體pINQ-BtH6-G8 的構建及轉化
        2.2.3 融合蛋白的表達、純化及鑒定
        2.2.4 酶催化生物素法和化學生物素法制備的生物素納米抗體靈敏度的比較
        2.2.5 基于G8-Biotin融合蛋白免疫分析法(BAS-FLEIA)的建立
    2.3 實驗結果
        2.3.1 質粒pINQ-BtH6-G8 的構建
        2.3.2 融合蛋白G8-Biotin的誘導表達、純化及鑒定
        2.3.3 納米抗體融合前后的活性分析
        2.2.4 酶催化生物素法和化學生物素法標記納米抗體G8對AFB₁ 抑制曲線的影響
        2.2.5 基于G8-Biotin建立了檢測谷物中AFB₁的BAS-FLEIA
        2.2.6 實際樣品的檢測
    2.4 討論與小結
        2.4.1 討論
        2.4.2 小結
第3章 抗AFB₁納米抗體-熒光素酶融合蛋白表達及應用的研究
    3.1 材料、儀器與試劑
        3.1.1 主要材料
        3.1.2 主要儀器
        3.1.3 試劑
    3.2 方法與步驟
        3.2.1 原核表達載體pET22b(+)-G8-Nluc的構建
        3.2.2 融合蛋白G8-Nluc的表達
        3.2.3 融合蛋白G8-Nluc活性分析
        3.2.4 基于G8-Nluc直接競爭一步生物熒光酶聯免疫分析法的建立
        3.2.5 One-step BLEIA反應體系的優(yōu)化
        3.2.6 基于G8-Nluc的直接競爭一步生物熒光酶聯免疫分析法的驗證
    3.3 實驗結果
        3.3.1 原核表達載體pET22b-G8-Nluc構建
        3.3.2 G8-Nluc融合蛋白的制備
        3.3.3 pET22b-G8-Nluc的活性分析
        3.3.4 基于G8-Nluc融合蛋白建立直接競爭一步生物熒光酶聯免疫分析法
    3.4 討論與小結
        3.4.1 討論
        3.4.2 小結
第4章 基于G8-CTB和花狀納米金免疫層析檢測技術檢測黃曲霉毒素B₁ 的應用研究
    4.1 實驗材料
        4.1.1 主要材料及試劑
        4.1.2 儀器設備
        4.1.3 主要溶劑和培養(yǎng)基
    4.2 方法與步驟
        4.2.1 五價納米抗體載體pET-CT-G8 的構建及融合蛋白的表達
        4.2.3 膠體金的制備與表征
        4.2.4 試紙條組裝
        4.2.5 膠體金探針的制備
        4.2.6 試紙條的制備
        4.2.7 免疫層析試紙條免疫反應分析
        4.2.8 試紙條性能的優(yōu)化
    4.3 實驗結果
        4.3.1 納米抗體活性的鑒定
        4.3.2 AuNFs溶液的制備及鑒定
        4.3.3 金標探針合成最適pH值和納米抗體量的優(yōu)化
        4.3.4 納米抗體試紙條的制備
        4.3.5 膠體金試紙條性能的測定
    4.4 討論與小結
        4.4.1 討論
        4.4.2 小結
第5章 抗AFB₁ 納米抗體隨機突變庫的構建、淘選和鑒定
    5.1 材料、儀器和試劑
        5.1.1 主要材料和試劑
        5.1.2 主要儀器
        5.1.3 主要溶液和培養(yǎng)基
    5.2 方法與步驟
        5.2.1 突變文庫的構建(易錯PCR)
        5.2.2 隨機突變庫的親和淘選
        5.2.3 間接競爭phage-ELISA分析陽性克隆的活性
    5.3 實驗結果
        5.3.1 易錯PCR條件的優(yōu)化
        5.3.2 隨機突變文庫的鑒定
        5.3.3 抗AFB₁ 納米抗體隨機突變庫的淘選
        5.3.4 噬菌粒的救援與鑒定
        5.3.5 陽性克隆序列與活性分析
        5.3.6 突變子靈敏度變化機制的討論
    5.4 討論與小結
        5.4.1 討論
        5.4.2 小結
第6章 結論與展望
    6.1 結論
        6.1.1 生物素化納米抗體的制備及應用
        6.1.2 納米抗體-納米熒光素酶(G8-Nluc)的融合表達、活性分析及應用
        6.1.3 基于五價納米抗體單體的免疫層析檢測技術的研究和應用
        6.1.4 抗AFB₁ 納米抗體隨機突變庫的構建、淘選和鑒定
    6.2 展望
    6.3 創(chuàng)新點
致謝
參考文獻
附錄A 氨基酸基本信息表
攻讀學位期間的研究成果



本文編號：3959523