黃曲霉毒素B₁(AFB₁)分布廣泛,可以致癌、致畸和致突變,且在食品中檢出率較高,嚴(yán)重威脅人類和動(dòng)物的健康。酶聯(lián)免疫分析技術(shù)和膠體金免疫層析技術(shù)因其特異性強(qiáng)、高通量、簡(jiǎn)單快速、低成本等優(yōu)點(diǎn)成為檢測(cè)黃曲霉毒素的常用方法之一。然而,隨著人們對(duì)食品安全和質(zhì)量的要求越來(lái)越嚴(yán)格,這兩種免疫學(xué)分析方法由于其檢測(cè)靈敏度偏低的局限性,已經(jīng)無(wú)法滿足某些實(shí)際應(yīng)用的需求。因此如何提高這兩大免疫學(xué)檢測(cè)方法的靈敏度已成為當(dāng)前亟待解決的主要問(wèn)題。駝源性納米抗體作為目前體積最小的基因工程抗體,具有穩(wěn)定性高、生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量高,易于遺傳信息改造、成本低等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)等領(lǐng)域。為了提高酶聯(lián)免疫分析技術(shù)和膠體金免疫層析技術(shù)的檢測(cè)靈敏度,本文以駝源性納米抗體為主要實(shí)驗(yàn)材料,緊緊圍繞著提高檢測(cè)信號(hào)的靈敏度和改進(jìn)免疫學(xué)元件親和力兩個(gè)策略進(jìn)行了如下研究:1生物素化納米抗體的制備及應(yīng)用的研究(策略一:提高檢測(cè)信號(hào)的靈敏度)通過(guò)化學(xué)生物素法和酶催化生物素法標(biāo)記納米抗體,得到了三種生物素化納米抗體,即G8-L-Biotin(長(zhǎng)臂)、G8-S-Biotin(短臂)和G8-B...

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語(yǔ)
第1章 引言
    1.1 黃曲霉毒素B₁的研究進(jìn)展
        1.1.1 黃曲霉毒素B
        1.1.2 AFB₁ 的限量標(biāo)準(zhǔn)
        1.1.3 AFB₁ 免疫學(xué)檢測(cè)方法的研究進(jìn)展
    1.2 納米抗體技術(shù)研究進(jìn)展
        1.2.1 納米抗體的特點(diǎn)
        1.2.2 納米抗體在小分子化合物檢測(cè)中的應(yīng)用
        1.2.3 納米抗體的進(jìn)化
    1.3 主要研究?jī)?nèi)容和意義
        1.3.1 研究?jī)?nèi)容
        1.3.2 研究意義
第2章 基于抗AFB₁生物素化納米抗體融合蛋白的研究
    2.1 材料、儀器與試劑
        2.1.1 主要材料
        2.1.2 主要儀器
        2.1.3 主要溶液和培養(yǎng)基
    2.2 方法與步驟
        2.2.1 化學(xué)生物素標(biāo)記法
        2.2.2 表達(dá)載體pINQ-BtH6-G8 的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化
        2.2.3 融合蛋白的表達(dá)、純化及鑒定
        2.2.4 酶催化生物素法和化學(xué)生物素法制備的生物素納米抗體靈敏度的比較
        2.2.5 基于G8-Biotin融合蛋白免疫分析法(BAS-FLEIA)的建立
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 質(zhì)粒pINQ-BtH6-G8 的構(gòu)建
        2.3.2 融合蛋白G8-Biotin的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及鑒定
        2.3.3 納米抗體融合前后的活性分析
        2.2.4 酶催化生物素法和化學(xué)生物素法標(biāo)記納米抗體G8對(duì)AFB₁ 抑制曲線的影響
        2.2.5 基于G8-Biotin建立了檢測(cè)谷物中AFB₁的BAS-FLEIA
        2.2.6 實(shí)際樣品的檢測(cè)
    2.4 討論與小結(jié)
        2.4.1 討論
        2.4.2 小結(jié)
第3章 抗AFB₁納米抗體-熒光素酶融合蛋白表達(dá)及應(yīng)用的研究
    3.1 材料、儀器與試劑
        3.1.1 主要材料
        3.1.2 主要儀器
        3.1.3 試劑
    3.2 方法與步驟
        3.2.1 原核表達(dá)載體pET22b(+)-G8-Nluc的構(gòu)建
        3.2.2 融合蛋白G8-Nluc的表達(dá)
        3.2.3 融合蛋白G8-Nluc活性分析
        3.2.4 基于G8-Nluc直接競(jìng)爭(zhēng)一步生物熒光酶聯(lián)免疫分析法的建立
        3.2.5 One-step BLEIA反應(yīng)體系的優(yōu)化
        3.2.6 基于G8-Nluc的直接競(jìng)爭(zhēng)一步生物熒光酶聯(lián)免疫分析法的驗(yàn)證
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 原核表達(dá)載體pET22b-G8-Nluc構(gòu)建
        3.3.2 G8-Nluc融合蛋白的制備
        3.3.3 pET22b-G8-Nluc的活性分析
        3.3.4 基于G8-Nluc融合蛋白建立直接競(jìng)爭(zhēng)一步生物熒光酶聯(lián)免疫分析法
    3.4 討論與小結(jié)
        3.4.1 討論
        3.4.2 小結(jié)
第4章 基于G8-CTB和花狀納米金免疫層析檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)黃曲霉毒素B₁ 的應(yīng)用研究
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 主要材料及試劑
        4.1.2 儀器設(shè)備
        4.1.3 主要溶劑和培養(yǎng)基
    4.2 方法與步驟
        4.2.1 五價(jià)納米抗體載體pET-CT-G8 的構(gòu)建及融合蛋白的表達(dá)
        4.2.3 膠體金的制備與表征
        4.2.4 試紙條組裝
        4.2.5 膠體金探針的制備
        4.2.6 試紙條的制備
        4.2.7 免疫層析試紙條免疫反應(yīng)分析
        4.2.8 試紙條性能的優(yōu)化
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 納米抗體活性的鑒定
        4.3.2 AuNFs溶液的制備及鑒定
        4.3.3 金標(biāo)探針合成最適pH值和納米抗體量的優(yōu)化
        4.3.4 納米抗體試紙條的制備
        4.3.5 膠體金試紙條性能的測(cè)定
    4.4 討論與小結(jié)
        4.4.1 討論
        4.4.2 小結(jié)
第5章 抗AFB₁ 納米抗體隨機(jī)突變庫(kù)的構(gòu)建、淘選和鑒定
    5.1 材料、儀器和試劑
        5.1.1 主要材料和試劑
        5.1.2 主要儀器
        5.1.3 主要溶液和培養(yǎng)基
    5.2 方法與步驟
        5.2.1 突變文庫(kù)的構(gòu)建(易錯(cuò)PCR)
        5.2.2 隨機(jī)突變庫(kù)的親和淘選
        5.2.3 間接競(jìng)爭(zhēng)phage-ELISA分析陽(yáng)性克隆的活性
    5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.3.1 易錯(cuò)PCR條件的優(yōu)化
        5.3.2 隨機(jī)突變文庫(kù)的鑒定
        5.3.3 抗AFB₁ 納米抗體隨機(jī)突變庫(kù)的淘選
        5.3.4 噬菌粒的救援與鑒定
        5.3.5 陽(yáng)性克隆序列與活性分析
        5.3.6 突變子靈敏度變化機(jī)制的討論
    5.4 討論與小結(jié)
        5.4.1 討論
        5.4.2 小結(jié)
第6章 結(jié)論與展望
    6.1 結(jié)論
        6.1.1 生物素化納米抗體的制備及應(yīng)用
        6.1.2 納米抗體-納米熒光素酶(G8-Nluc)的融合表達(dá)、活性分析及應(yīng)用
        6.1.3 基于五價(jià)納米抗體單體的免疫層析檢測(cè)技術(shù)的研究和應(yīng)用
        6.1.4 抗AFB₁ 納米抗體隨機(jī)突變庫(kù)的構(gòu)建、淘選和鑒定
    6.2 展望
    6.3 創(chuàng)新點(diǎn)
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄A 氨基酸基本信息表
攻讀學(xué)位期間的研究成果



本文編號(hào)：3959523