γ-谷氨酰肽廣泛分布于自然界中,參與生命體的多種生理活動。谷氨酰胺酶（EC3.5.1.2）是一種水解酶,同時具有轉(zhuǎn)肽作用。本論文篩選出利于催化γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽反應(yīng)的谷氨酰胺酶,酶促合成一種未被報道的γ-谷氨酰肽(γ-[Glu]_n（1-5）-Gln),進一步探究外部條件對其合成的影響及其鈣離子螯合能力和抗凍性。實驗結(jié)果如下:首先研究兩種解淀粉芽孢桿菌源谷氨酰胺酶（E1和E2）的酶學(xué)特性。結(jié)果表明,E1和E2均能催化水解和轉(zhuǎn)肽反應(yīng);在p H值10.0、37.0℃下,E1的水解活性優(yōu)于E2,轉(zhuǎn)肽活性二者無明顯差別（P<0.05）;在p H值4.0-10.0、4.0-45.0℃,E1的耐受性優(yōu)于E2;色氨酸、脯氨酸、精氨酸、蘇氨酸和谷氨酰胺均可作為E1催化γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽反應(yīng)時的最佳γ-谷氨酰受體。因此,選用E1作為后續(xù)實驗用酶。其次利用E1酶促合成γ-[Glu]_n（1-5）-Gln,并探究底物濃度和初始p H值對其合成的影響。結(jié)果表明,E1具有催化合成γ-[Glu]_n（1-5）-Gln的能力;UPLC-MS/MS鑒定出酶促反... 

【文章來源】：華南理工大學(xué)廣東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

pH值對兩種谷氨酰胺酶水解和轉(zhuǎn)肽酶活的影響

華南理工大學(xué)碩士學(xué)位論文20有關(guān)[129]。由圖2-1還可以看出，在pH值為3.0時，E1沒有水解酶活，轉(zhuǎn)肽相對酶活仍有25.18%，E2基本失活；隨著pH值增加，E1和E2的水解相對酶活先逐漸增加，分別在pH值為11.0和10.0時達到峰值，隨后下降；在pH值為12.0時E1水解相對酶活降至54.40%，E2水解相對酶活降至47.46%；二者的轉(zhuǎn)肽相對酶活起初也隨著pH值增加逐漸增加，在最適pH值時達到峰值后下降，在pH值為12.0時E1轉(zhuǎn)肽相對酶活降至70.88%，E2轉(zhuǎn)肽相對酶活降至15.54%。這些結(jié)果表明E1比E2對強酸、強堿條件具有更強的耐受性。圖2-2pH值對兩種谷氨酰胺酶水解和轉(zhuǎn)肽酶活穩(wěn)定性的影響Figure2-2EffectofpHonthestabilityofhydrolaseactivityandtranspeptidaseactivityoftwoglutaminases由圖2-2可以看出，在pH值4.0-10.0范圍內(nèi)，兩種谷氨酰胺酶的水解和轉(zhuǎn)肽相對酶活均比較穩(wěn)定，在此pH值范圍內(nèi)保持24.0h后水解和轉(zhuǎn)肽相對酶活均能保持80%以上。楊娟發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌源谷氨酰胺酶在pH值6.0-11.0范圍內(nèi)的溶液中保存24.0h后其轉(zhuǎn)肽相對酶活均可保持在90%以上[48]。楊成等人發(fā)現(xiàn)硝基還原假單胞菌源谷氨酰胺酶在pH值5.0-11.0范圍內(nèi)水解酶活基本保持穩(wěn)定[134]。這些報道與本研究有些差異，可能是菌種來源不同、培養(yǎng)條件以及產(chǎn)物的分離純化工藝不同和測定方法不同導(dǎo)致的。從圖2-2還可以看出，在pH值12.0環(huán)境下保持24.0h后，兩種谷氨酰胺酶均已失活，而在pH值11.0環(huán)境下保持24.0h后，E1水解相對酶活為93.61%，轉(zhuǎn)肽相對酶活為91.90%，E2水解相對酶活為63.16%，轉(zhuǎn)肽相對酶活為68.76%，這些結(jié)果表明E1比E2對強堿條件具有更強的耐受性。

第二章兩種谷氨酰胺酶的酶學(xué)特性研究212.3.3溫度對谷氨酰胺酶水解和轉(zhuǎn)肽酶活的影響由圖2-3可以看出，兩種谷氨酰胺酶催化水解和轉(zhuǎn)肽反應(yīng)的最適反應(yīng)溫度不同，E1催化水解和轉(zhuǎn)肽反應(yīng)的最適反應(yīng)溫度為45.0和37.0℃，E2催化水解和轉(zhuǎn)肽反應(yīng)的最適反應(yīng)溫度為37.0和45.0℃，這和盧慧茵等人報道的有所不同，可能和菌種的培養(yǎng)條件以及產(chǎn)物的分離純化工藝有關(guān)[129]。由圖2-3還可以看出，二者的水解和轉(zhuǎn)肽相對酶活起初隨著反應(yīng)溫度的上升逐漸增加，在最適反應(yīng)溫度達到峰值后降低。E1在75.0℃時水解和轉(zhuǎn)肽相對酶活保持在13.00%和31.04%，E2對反應(yīng)溫度更敏感，在75.0℃時已基本失活。這是因為適當(dāng)?shù)臏囟忍岣哂欣诜磻?yīng)的正向進行，而當(dāng)溫度過高時，蛋白變性導(dǎo)致酶的分子結(jié)構(gòu)遭到破壞而失去活力[129]。圖2-3溫度對兩種谷氨酰胺酶水解和轉(zhuǎn)肽酶活的影響Figure2-3Effectoftemperatureonthehydrolaseactivityandtranspeptidaseactivityoftwoglutaminases由圖2-4可以看出，E1在4.0、25.0、37.0、45.0和55.0℃下水解酶活穩(wěn)定，保存240.0min仍能保持80%以上相對酶活，在65.0和75.0℃下保存30.0min后基本無水解酶活，轉(zhuǎn)肽酶活在45.0℃下隨著保存時間延長而降低，在55.0、65.0和75.0℃下保存30.0min后基本無轉(zhuǎn)肽酶活；E2在4.0、25.0和37.0℃水解和轉(zhuǎn)肽酶活都很穩(wěn)定，在45.0℃下隨著保存時間延長水解和轉(zhuǎn)肽酶活都下降，在55.0、65.0和75.0℃下保存30.0min后基本失活�？梢钥闯鯡1比E2更耐高溫，在45.0和55.0℃下溫度穩(wěn)定性更好。綜合以上結(jié)果，短時間酶促反應(yīng)時，谷氨酰胺酶的酶活在一定范圍內(nèi)隨著溫度升高而升高，但長時間酶促反應(yīng)時，谷氨酰胺酶的酶活會降低。這是因為短時間內(nèi)溫度升高，

【參考文獻】：
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博士論文
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本文編號：3585308