腸粘膜是維持腸道穩(wěn)態(tài)的重要屏障。缺氧（Hypoxia,H）引發(fā)小腸上皮屏障功能損傷,修復(fù)能力下降,導(dǎo)致腸道疾病的發(fā)生。牛乳來源外泌體可以調(diào)節(jié)腸道健康,其中微小核糖核酸（micro RNAs,miRNAs）被認(rèn)為是外泌體中潛在重要功能執(zhí)行者。牦牛作為高原地區(qū)的生物,具有耐寒、抗缺氧、抗輻射等特性。我們猜測牦牛乳來源外泌體中miRNA能夠緩解腸道缺氧損傷。本研究首先對牦牛乳外泌體（Yak milk exosome,Yak-Exo）提取方法進(jìn)行優(yōu)化。在此基礎(chǔ)上,探討分析牦牛乳外泌體調(diào)控大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞（The intestinal epithelium cells,IEC-6）缺氧損傷的作用,比較牦牛乳與荷斯坦奶牛乳外泌體中miRNA的差異,篩選牦牛乳外泌體中與缺氧相關(guān)miRNA。進(jìn)一步闡明牦牛乳外泌體中bta-miR-31與bta-miR-34a調(diào)控IEC-6細(xì)胞缺氧損傷的分子機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:1.牦牛乳外泌體提取方法的優(yōu)化為了深入研究Yak-Exo中miRNA緩解腸道缺氧損傷的作用,首先需要獲取高純度的Yak-Exo。本研究以牦牛乳為研究對象,分別采用傳統(tǒng)超高速離心法（Meth... 

【文章來源】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)甘肅省

【文章頁數(shù)】：110 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
SUMMARY
英文縮略圖表
第一章 緒論
    1.1 牦牛乳的特征組分和功能
    1.2 外泌體的來源、組分及功能
        1.2.1 外泌體的來源
        1.2.2 外泌體的組分
        1.2.3 食物來源外泌體的功能
    1.3 micro RNA的作用特點(diǎn)和機(jī)制
        1.3.1 micro RNA的生物合成
        1.3.2 micro RNA的作用機(jī)制
        1.3.3 食物來源miRNA的功能
    1.4 缺氧造成腸道損傷的分子機(jī)制
        1.4.1 腸道屏障功能與腸上皮細(xì)胞損傷的聯(lián)系
        1.4.2 缺氧信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路
        1.4.3 細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路
    1.5 立題依據(jù)
    1.6 研究目的和意義
    1.7 技術(shù)路線
第二章 牦牛乳外泌體提取方法的優(yōu)化
    2.1 引言
    2.2 試驗(yàn)材料和方法
        2.2.1 主要儀器
        2.2.2 牛奶樣品的準(zhǔn)備
        2.2.3 Yak-Exo的提取方法優(yōu)化和濃度檢測
        2.2.4 Yak-Exo的鑒定
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 Exosomes濃度測定
        2.3.2 Exosomes透射電鏡分析
        2.3.3 Exosomes的粒徑分析
        2.3.4 Exosomes表征蛋白表達(dá)
        2.3.5 Exosomes流式分析
    2.4 討論
        2.4.1 牦牛乳外泌體提取方法的優(yōu)化
        2.4.2 牛乳外泌體的鑒定
    2.5 結(jié)論
第三章 牦牛乳外泌體緩解小腸上皮細(xì)胞缺氧損傷的影響
    3.1 引言
    3.2 試驗(yàn)材料和方法
        3.2.1 主要儀器
        3.2.2 樣品的準(zhǔn)備
        3.2.3 Yak-Exo與 Cow-Exo的提取和濃度檢測
        3.2.4 Yak-Exo的鑒定
        3.2.5 大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞的培養(yǎng)
        3.2.6 MTT法檢測細(xì)胞增殖
        3.2.7 IEC-6 細(xì)胞對外泌體的攝取試驗(yàn)
        3.2.8 Western Blot檢測
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 牦牛乳與荷斯坦奶牛乳外泌體特征比較
        3.3.2 牦牛乳外泌體對IEC-6 細(xì)胞增殖的影響
        3.3.3 牦牛乳外泌體對IEC-6 細(xì)胞內(nèi)吞的影響
        3.3.4 牦牛乳外泌體對IEC-6 細(xì)胞中p53和HIF信號蛋白影響
    3.4 討論
        3.4.1 牦牛乳外泌體形態(tài)特征
        3.4.2 牦牛乳外泌體緩解IEC-6 細(xì)胞缺氧損傷影響
        3.4.3 IEC-6 細(xì)胞攝取牦牛乳外泌體的影響
        3.4.4 牦牛乳外泌體調(diào)節(jié)p53和HIF信號蛋白緩解IEC-6 細(xì)胞缺氧損傷影響
    3.5 結(jié)論
第四章 牦牛乳與荷斯坦奶牛乳外泌體中microRNAs的分析與鑒定
    4.1 引言
    4.2 試驗(yàn)材料和方法
        4.2.1 主要儀器
        4.2.2 Yak-Exo和 Cow-Exo樣品的準(zhǔn)備
        4.2.3 Yak-Exo和 Cow-Exo中 miRNA提取及質(zhì)量鑒定
        4.2.4 文庫構(gòu)建、測序及數(shù)據(jù)分析
        4.2.5 PCR驗(yàn)證
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 總RNA濃度檢測結(jié)果
        4.3.2 測序數(shù)據(jù)概述及特征
        4.3.3 差異表達(dá)miRNA熒光定量驗(yàn)證
    4.4 討論
    4.5 結(jié)論
第五章 bta-miR-31和bta-miR-34a緩解IEC-6 細(xì)胞缺氧損傷的影響
    5.1 引言
    5.2 試驗(yàn)材料和方法
        5.2.1 大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞的培養(yǎng)
        5.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        5.2.3 PCR驗(yàn)證
        5.2.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖
        5.2.5 免疫熒光檢測
        5.2.6 Western Blot檢測
        5.2.7 雙熒光素酶驗(yàn)證靶基因
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 轉(zhuǎn)染效率檢測
        5.3.2 bta-miR-31 對缺氧誘導(dǎo)下IEC-6 細(xì)胞生存能力的影響
        5.3.3 bta-miR-34a對缺氧誘導(dǎo)下IEC-6 細(xì)胞生存能力的影響
        5.3.4 bta-miR-31 對缺氧誘導(dǎo)HIF信號通路蛋白的調(diào)控作用
        5.3.5 bta-miR-31 對缺氧誘導(dǎo)下細(xì)胞凋亡信號通路蛋白的調(diào)控作用
        5.3.6 bta-miR-34a對缺氧誘導(dǎo)下HIF信號通路蛋白的調(diào)控作用
        5.3.7 bta-miR-34a對缺氧誘導(dǎo)下抗凋亡p53 信號通路蛋白的調(diào)控作用
        5.3.8 bta-miR-31與miR-34a靶基因預(yù)測
    5.4 討論
        5.4.1 bta-miR-31/34a對缺氧誘導(dǎo)下IEC-6 細(xì)胞生存能力的影響
        5.4.2 bta-miR-31/34a對缺氧誘導(dǎo)下HIF信號通路蛋白的調(diào)控作用
        5.4.3 bta-mi R-31/34a 對缺氧誘導(dǎo)下細(xì)胞凋亡信號通路蛋白的調(diào)控作用
        5.4.4 bta-mi R-31與 bta-mi R-34靶基因預(yù)測
    5.5 結(jié)論
第六章 全文總結(jié)與創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡歷
導(dǎo)師簡介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]牦牛乳物理化學(xué)特性的研究進(jìn)展[J]. 李海梅,何勝華,劉天一,馬鶯.  中國乳品工業(yè). 2009(08)
[2]Mechanisms of caspase activation and inhibition during apoptosis[J].   Cell Research. 2002(Z1)
[3]中國的牦牛資源[J]. 陸仲磷.  中國草食動(dòng)物. 1999(02)
[4]長期居住海平后藏族經(jīng)受急性減壓低氧時(shí)的心泵和呼吸功能[J]. 周兆年,王利華,袁鋒,姜楞,潘翠珍,何軍.  科學(xué)通報(bào). 1992(03)

博士論文
[1]青藏高原高寒植物及牦牛奶抗氧化特性研究[D]. 崔光欣.蘭州大學(xué) 2016
[2]大熊貓不同泌乳期乳汁microRNA表達(dá)譜研究[D]. 王承東.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015

碩士論文
[1]牦牛MMP3、ADAM17、ARG2基因SNPs與其高原低氧適應(yīng)性相關(guān)分析[D]. 周長卿.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014



本文編號：3175559