脂肪酶是一種極具商業(yè)價(jià)值的絲氨酸水解酶類,可用于食品、醫(yī)藥、化工等行業(yè)。但大多數(shù)天然脂肪酶都存在穩(wěn)定性差、易變性失活以及不可回收利用等缺點(diǎn),這導(dǎo)致脂肪酶的應(yīng)用受到限制。因此,本研究采用來(lái)自于黑曲霉GZUF36的胞外脂肪酶（extracellular lipase from Aspergillus niger GZUF36,ANL）進(jìn)行交聯(lián)酶聚集體（Cross-linked enzyme aggregates,CLEAs）制備,以獲得酶活力高、穩(wěn)定性強(qiáng)且可多次回收利用的固定化脂肪酶。此外,通過(guò)對(duì)黑曲霉GZUF36胞外脂肪酶交聯(lián)酶聚集體（CLEAs-ANL）酶學(xué)性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、形態(tài)外貌以及選擇性進(jìn)行研究,為后續(xù)該酶在功能性油脂的合成以及工業(yè)化大規(guī)模應(yīng)用提供參考依據(jù)和理論基礎(chǔ)。主要內(nèi)容和結(jié)果如下:（1）當(dāng)叔丁醇與粗酶液體積為4:1,交聯(lián)劑添加量為30μl,交聯(lián)時(shí)間為1.5小時(shí),離心轉(zhuǎn)數(shù)為6000 r/min時(shí)為制備CLEAs-ANL的最佳條件。在該條件下,CLEAs-ANL酶活回收率為100.3±1.1%,酶活力可達(dá)13.8±0.51 u/ml。研究了不同添加劑如BSA、BSA水解產(chǎn)物、油酸... 

【文章來(lái)源】：貴州大學(xué)貴州省 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：89 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

CO2分散反膠束溶液制備交聯(lián)酶聚集體（CLEAs）的TEM照片(Chenetal.,2006)

C3鍵處被特異性切割，形成兩個(gè)反應(yīng)性醛基。這些生成的二醛基團(tuán)對(duì)賴氨酸殘基中的氨基特別活潑，可形成席夫堿，從而替代GLA成為一種可再生且無(wú)毒的交聯(lián)劑(Nadar et al., 2016)。如圖1.3所示，一些溫和的交聯(lián)劑如乙二醇-雙[琥珀酸N-羥基琥珀酰亞胺]（EG-NHS）可以取代GLA用于青霉菌脂肪酶CLEAs的制備，該交聯(lián)劑主要通過(guò)N-羥基琥珀酰亞胺酯形成穩(wěn)定的酰胺鍵來(lái)交聯(lián)蛋白質(zhì)，制得的EG-NHS聚集體較用戊二醛制備的CLEAs具有更優(yōu)異的水解和酯化活性(Rehmanet al., 2016)。有研究(Mileti et al., 2009)表明CAL-B的熱穩(wěn)定性對(duì)雙環(huán)氧化物的交聯(lián)度及鏈長(zhǎng)度具有很強(qiáng)的依賴性。苯醌也被報(bào)道用作交聯(lián)劑，且制得的CLEAs在50℃孵育90 min后的熱穩(wěn)定性比用GLA制備的CLEAs高5倍(Wang et al., 2011)。對(duì)于一些酶而言，小分子的交聯(lián)劑可能會(huì)進(jìn)入蛋白質(zhì)內(nèi)部破壞它們的三級(jí)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酶活性完全喪失。此外，不少研究還致力于開(kāi)發(fā)葡聚糖和殼聚糖等大分子作交聯(lián)劑來(lái)制備CLEAs(Panwar et al., 2017)。

本研究選取了鹽（飽和的硫酸銨）、有機(jī)溶劑（叔丁醇、丙酮）、聚合物（聚乙烯醇）三種不同類型的沉淀劑制備CLEAs-ANL以研究它們對(duì)其活力的影響，結(jié)果如圖2.1所示。當(dāng)使用聚乙烯醇做沉淀劑時(shí)，酶活回收率顯著下降，這可能是由于聚乙烯醇不能使酶很好的沉降下來(lái)所導(dǎo)致，因?yàn)樵诓患咏宦?lián)劑的情況下，使用聚乙烯醇沉淀脂肪酶只觀察到少量沉淀物，且上清中仍能檢測(cè)到部分酶活。而使用飽和的硫酸銨做沉淀劑時(shí)，酶活回收率達(dá)到59.3±1.2%，但用硫酸銨做沉淀劑制備的CLEAs在水溶液中可能會(huì)產(chǎn)生溶解現(xiàn)象(張晶晶，2012)；相比之下，使用叔丁醇和丙酮做沉淀劑都可得到較好的結(jié)果

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]反膠束體系中脂肪酶催化合成單月桂酸甘油酯[J]. 張桂菊,王肖彥,王瑞,陳芳莉,徐寶財(cái).  中國(guó)油脂. 2019(01)
[2]復(fù)合交聯(lián)酶聚集體的制備及催化羰基不對(duì)稱還原合成手性醇[J]. 楊猛,江惠娟,寧晨曦,魏東芝,蘇二正.  高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào). 2018(01)
[3]具有菲環(huán)骨架的高分子載體固定淀粉酶交聯(lián)聚集體[J]. 黎克純,盧建芳,周菊英,許海棠,趙彥芝.  食品科學(xué). 2017(14)
[4]以大孔硅膠為載體的苯丙氨酸解氨酶交聯(lián)酶聚體的制備及性質(zhì)研究[J]. 李連連,崔建東.  食品工業(yè)科技. 2014(11)
[5]牛血清白蛋白輔助交聯(lián)對(duì)苯丙氨酸解氨酶交聯(lián)酶聚體影響的研究[J]. 孫立梅,李連連,崔建東.  食品工業(yè)科技. 2013(13)
[6]脂肪酶及其在飼料中的應(yīng)用[J]. 劉德海,解復(fù)紅,賈彬,陳國(guó)參,權(quán)淑靜,馬煥.  中國(guó)飼料. 2012(16)
[7]交聯(lián)酶聚體制備的研究進(jìn)展[J]. 張思,張亞楠,崔建東.  中國(guó)釀造. 2010(08)
[8]CTAB混合反膠團(tuán)萃取工業(yè)脂肪酶[J]. 沈睿,劉俊果,邢建民,劉會(huì)洲.  過(guò)程工程學(xué)報(bào). 2005(03)

博士論文
[1]原料奶中熒光假單胞菌耐熱性脂肪酶周質(zhì)表達(dá)及酶學(xué)特性研究[D]. 張維清.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2018
[2]新型交聯(lián)酶聚體技術(shù)及其在蛋白組學(xué)與生物催化中的應(yīng)用[D]. 王夢(mèng)凡.天津大學(xué) 2011
[3]氨基�；附宦�(lián)聚集體的制備及其催化性能研究[D]. 董濤.天津大學(xué) 2010
[4]黑曲霉脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)、基因克隆與表達(dá)及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)[D]. 舒正玉.華中科技大學(xué) 2007

碩士論文
[1]脂肪酶交聯(lián)聚集體的制備及其催化合成月桂酸淀粉酯[D]. 陳海龍.江南大學(xué) 2017
[2]反膠束法分離提純黑曲霉GZUF36胞外脂肪酶及其酶學(xué)性質(zhì)研究、酶的固定化[D]. 張富豪.貴州大學(xué) 2017
[3]磁性納米交聯(lián)酶聚集體的制備及其在微管式反應(yīng)器中的應(yīng)用[D]. 鄭德兵.北京化工大學(xué) 2017
[4]脂肪酶Candidia sp.99-125催化合成類可可脂工藝研究[D]. 劉墨硯.北京化工大學(xué) 2016
[5]嗜冷桿菌低溫脂肪酶分離純化及表征[D]. 張悅.大連理工大學(xué) 2015
[6]非水相介質(zhì)中微生物脂肪酶法高選擇性合成1,3-甘油二酯的研究[D]. 周換景.貴州大學(xué) 2014
[7]交聯(lián)脂肪酶聚集體體系構(gòu)建及其性質(zhì)研究[D]. 董守利.華南理工大學(xué) 2013
[8]三種堿性脂肪酶水解活性預(yù)測(cè)及構(gòu)效關(guān)系和洗滌性能研究[D]. 王孝杰.天津科技大學(xué) 2013
[9]交聯(lián)脂肪酶聚集體（CLEAs）的制備及其粒徑影響因素研究[D]. 張晶晶.北京化工大學(xué) 2012
[10]粗狀假絲酵母脂肪酶的分離純化水解乳脂的研究[D]. 董恒濤.華南理工大學(xué) 2010



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