植物源精油是一種新型抑菌劑,但是它的抑菌機(jī)理研究尚且停留在表層。本文研究了肉桂精油的主要成分反式肉桂醛的抑真菌機(jī)理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)反式肉桂醛的抑真菌機(jī)理是通過破壞細(xì)胞膜進(jìn)而抑制菌絲體生長(zhǎng),同時(shí)它還能破壞線粒體的功能,引發(fā)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。另外,作為全新的高靈敏度指紋性分析手段,拉曼光譜技術(shù)被運(yùn)用到了精油的抑真菌機(jī)理分析上。抑菌機(jī)理的研究有助于更好的開發(fā)出高效的天然抑菌劑。具體研究結(jié)果如下:首先,反式肉桂醛通過膜損傷機(jī)制發(fā)揮抑制菌絲體生長(zhǎng)的功效。反式肉桂醛可以改變細(xì)胞膜的通透性導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物質(zhì)的泄漏,比如核酸、蛋白質(zhì)、鉀離子等物質(zhì)。細(xì)胞可以被碘化丙啶染成紅色,表明細(xì)胞膜的整體性下降,最低由100.0±1%降至12.1±3%。同時(shí),掃描電鏡結(jié)果顯示處理后的菌絲表面出現(xiàn)凹凸不平的褶皺,細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征發(fā)生改變。然后,反式肉桂醛破壞了線粒體的正常功能并引發(fā)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。通過改變?nèi)人嵫h(huán)的相關(guān)酶活使三羧酸循環(huán)失調(diào),具體表現(xiàn)為檸檬酸的含量先上升后下降,琥珀酸脫氫酶的活力下降,由107.8±2.2 U最低降至52.7±5.3 U,蘋果酸脫氫酶的活力上升,由4.8±0.5 U最高上升至15.2±0.9 U。線粒體內(nèi)部呼吸鏈的電子大量泄漏,細(xì)胞內(nèi)部活性氧水平急劇升高,氧化還原水平失調(diào)。反式肉桂醛通過破壞線粒體膜整體性,引發(fā)線粒體膜電位的崩塌,導(dǎo)致細(xì)胞色素c泄漏,從而引發(fā)了凋亡蛋白酶的活化,具體表征為Caspase-3的活力由3.6±0.6 U上升至8.8±1.1 U,而后凋亡反應(yīng)級(jí)聯(lián)放大,細(xì)胞凋亡。最后,將靈敏度高、能提供指紋信息的拉曼光譜技術(shù)引入到精油抑真菌機(jī)理研究過程中。拉曼光譜和表面增強(qiáng)拉曼光譜方法在檢測(cè)精油抑菌過程中細(xì)胞內(nèi)部、外部的變化時(shí),能發(fā)揮良好的診斷作用。利用表面增強(qiáng)拉曼光譜快速檢測(cè)出細(xì)胞蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)的泄漏。具體表現(xiàn)為,胞外上清液中蛋白質(zhì)的特征峰1244 cm~(-1)峰強(qiáng)上升;核酸的特征峰734 cm~(-1)、1330 cm~(-1)、1338 cm~(-1)皆同時(shí)上升;另外,代表脂質(zhì)的特征峰1466 cm~(-1)的強(qiáng)度也上升。用共聚焦顯微拉曼光譜儀檢測(cè)線粒體中細(xì)胞色素c時(shí),發(fā)現(xiàn)其特征峰強(qiáng)度指標(biāo)I_(750)/I_(2944)下降,表示線粒體內(nèi)細(xì)胞色素c的量減少。另外,拉曼峰強(qiáng)可以與OD_(260)值、蛋白質(zhì)泄漏量和細(xì)胞色素c泄漏量等經(jīng)典分析方法之間建立強(qiáng)相關(guān)性,相關(guān)性系數(shù)都在0.9以上。以上研究結(jié)果表明,反式肉桂醛通過破壞細(xì)胞膜發(fā)揮抑制意大利青霉菌菌絲生長(zhǎng)的作用;通過激活線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑發(fā)揮抑菌功效;拉曼光譜和表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)可以很好的表征精油抑真菌過程中的物質(zhì)變化。
【學(xué)位單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：TS255.3;TS202.3
【部分圖文】：

1 緒 論示，用激光照射樣品后，入射光在樣品上發(fā)生拉曼散得到目標(biāo)分子相應(yīng)的拉曼圖譜。該方法提供了關(guān)于藥中的直接定量數(shù)據(jù)以及藥物-靶標(biāo)反應(yīng)的細(xì)節(jié)信息。拉維酸和他唑巴坦?jié)B入大腸桿菌細(xì)胞，隨后抑制細(xì)胞腸桿菌細(xì)胞含有與抑制劑形成穩(wěn)定復(fù)合物的 β-內(nèi)酰胺物的拉曼特征。從拉曼強(qiáng)度來看，很容易半定量地測(cè)克拉維酸分子的數(shù)量。

圖 1-2 表面增強(qiáng)拉曼光譜在抑菌過程中的應(yīng)用原理示意圖g. 1-2 Schematic diagram of application principle of surface-enhanced Raman spectroscopbacteriostatic process SERS 的單細(xì)胞分析也是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[62]，單細(xì)胞分析為從分子水平或平上研究抑菌機(jī)制提供了可能性，如若能將 SERS 聯(lián)合同位素標(biāo)記法[63]，像技術(shù)則能實(shí)現(xiàn)從單分子水平考察目標(biāo)分子在細(xì)胞內(nèi)的變化和分布[50,64,6是一個(gè)活躍的研究領(lǐng)域，目的是希望從單個(gè)活細(xì)胞中解讀群體生化過程。光譜技術(shù)已經(jīng)越來越多地用于單細(xì)胞分析，其能夠以非接觸、非侵入性和式提供關(guān)于活細(xì)胞中發(fā)生的分子過程的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)信息。例如 Kuku G 等人基于表面增強(qiáng)拉曼光譜的納米粒子毒性評(píng)估的新方法。在兩個(gè)模型細(xì)胞系模型 NM，并且通過 WST-1 細(xì)胞毒性測(cè)定和膜聯(lián)蛋白 V-FITC/碘化丙啶染亡-壞死實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，SERS 可檢測(cè)細(xì)胞毒性，評(píng)估繞過 NM耗費(fèi)的人力物力更少。的，SERS 作為一種非侵入性技術(shù)，自然可以檢測(cè)線粒體膜內(nèi)膜外的許多重

1 緒 論TC 的氧化還原狀態(tài)和 Cytc 的構(gòu)象。他們首先構(gòu)建了銀納米粒子混合，將銀納米粒子附著在線粒體表面，光譜，該光譜提供了活的線粒體內(nèi)膜電位、質(zhì)子梯度和為的特征信息。銀粒子在線粒體表面的附著情況如下及膜間隙的厚度為 SERS 檢測(cè) Cytc（圖中藍(lán)色球）提在于它只能用于研究在分離線粒體中的 Cyt c，而不，因?yàn)榧{米結(jié)構(gòu)不能被內(nèi)吞。
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