高尿酸血癥是指人體血尿酸水平長期處于過飽和狀態(tài)所引起的一系列癥狀總稱,是誘發(fā)系列健康問題重要因素之一。目前常用的降尿酸藥物(如別嘌呤醇)由于具有顯著依賴性與毒副作用,使得天然安全高效的降尿酸肽的研究和開發(fā)日趨升溫。前期實驗研究發(fā)現(xiàn)金槍魚蛋白水解物(TPH)可顯著抑制高尿酸血癥大鼠血清中黃嘌呤氧化酶(XO)活性,從而降低其血尿酸水平。本文旨在明晰TPH中黃嘌呤氧化酶抑制肽構(gòu)效關(guān)系及XO抑制作用機制。首先通過對比不同緩沖試劑對TPH體外XO抑制活性的影響,獲得最優(yōu)體外XO抑制率檢測模型,結(jié)合多種分離手段從TPH中富集強XO抑制活性組分,并通過質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定其氨基酸序列;采用固相合成法獲得目標(biāo)XO抑制肽,綜合XO抑制活性及其殘基與XO相互作用特點,分析XO抑制肽的構(gòu)效關(guān)系及其XO抑制作用分子機制,為XO抑制肽研究與降尿酸肽產(chǎn)品開發(fā)提供理論和方法的參考。(1)針對目前未考慮不同緩沖體系中離子類型及強度對多肽和酶構(gòu)象的影響,而直接參考其它小分子抑制劑活性測定方法來測定多肽XO抑制率的問題。本論文對比探究了三種常用緩沖試劑對多肽XO抑制率測定結(jié)果的影響。結(jié)果表明TPH在三種緩沖液中未見明顯結(jié)構(gòu)變化,但緩沖液HEPES與XO和TPH會產(chǎn)生相互作用,降低XO的α-螺旋含量,使得酶結(jié)構(gòu)更加松弛,從而導(dǎo)致TPH在HEPES體系中具有更高的XO抑制率,為評價緩沖試劑對體外天然大分子生物活性的影響研究提供了參考。(2)采用乙醇溶液和Sephadex G-15對TPH中XO抑制多肽進(jìn)行高效分離。結(jié)果發(fā)現(xiàn)醇溶組分(ESF)的XO抑制活性最好,這可能與其中含有更多疏水性氨基酸殘基和1 kDa的肽密切相關(guān);采用體外XO抑制率為篩選指標(biāo),從Sphadex G-15 8個分離組分中確認(rèn)P6組分活性最佳;并通過UPLC-Q-TOF-MS/MS從中鑒定出13條肽,其中FH的XO抑制活性最佳。同時對比本研究HPLC法和文獻(xiàn)中使用的UV方法測定13條肽的XO抑制活性,發(fā)現(xiàn)UV法并不適用于測定包含Trp的肽。(3)利用分子對接方法探究了本研究鑒定的XO抑制肽與XO相互作用模式。首先歸納了已知抑制劑配體與XO的作用特點。通過XO抑制肽FH的抑制作用機制研究發(fā)現(xiàn),FH可與底物競爭XO活性中心位點,并與XO活性中心Phe-914、Ser-876及Thr-1010殘基之間存在相互作用,從而起到抑制XO活性作用。此外,Phe對肽的XO抑制活性至關(guān)重要,且堿性氨基酸能增強含Phe殘基寡肽的XO抑制活性。
【學(xué)位單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：TS254.4
【部分圖文】：

圖 1-2 黃嘌呤氧化酶結(jié)構(gòu)簡圖Figure 1-2 The structure of Xanthine Oxidase抑制劑上主要應(yīng)對高尿酸血癥以及其引起的系列疾病減少血管氧化應(yīng)激和血液中尿酸水平[19]。XO位點（包括抑制劑別嘌呤醇）[20]和 FAD 輔助機化合物，由稠合芳香族和咪唑組成的環(huán)狀化嘌呤的相似程度可以將XO抑制劑分為嘌呤類布索坦和黃酮類化合物）[14,22,23]。為廣泛的 XO 抑制劑類降尿酸藥物是別嘌呤醇爭性抑制劑，能夠占據(jù)底物嘌呤在 XO 上的活

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）抑制作用和抗菌作用）的優(yōu)劣。ESF、TPH 和 EIF 的水性氨基酸含量與 XO 抑制活性存在一致性，因此可以判斷 TPH 中部分疏水性氨基殘基對其 XO 抑制活性可能具有一定貢獻(xiàn)作用。由于 XO 的活性中心由疏水口袋組成該結(jié)構(gòu)作為重要的結(jié)構(gòu)域，是 XO 抑制劑發(fā)揮功能重要的區(qū)域。因此疏水性相對較強多肽更容易通過疏水相互作用進(jìn)入 XO 活性中心發(fā)揮抑制功能。3.3.4 Sephadex G-15 分離與活性分析凝膠色譜柱是一種分子排阻色譜柱，能夠?qū)⑸锎蠓肿訕悠钒凑辗至看笮№樞蜻M(jìn)洗脫分離。其中 Sephadex G-15 凝膠柱適用于分離分子量低于 1500 Da 的多肽。在本究中，Sephadex G-15 用于進(jìn)一步分離純化 ESF，分別獲得了八個組分（按順序標(biāo)記P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7 和 P8，圖 3-3a）。這八個組分的 XO 抑制率（測定濃度8 mg/mL）如圖 3-3b 所示。其中 P6 具有最高的 XO 抑制率（67.5±2.8％），而 P7 組最低。

華南理工大學(xué)碩士學(xué)位論文以歸納出幾個有關(guān)抑制劑配體與酶活性中心相互作用的重要信 XO 的 π-π 相互作用：所選取的 8 個抑制劑配體均能與 XO 活成錯位面對面 π-π 堆積作用；其中 6-巰基嘌呤、LUZ、槲皮素還能夠與 XO 活性中心的 Phe-1009 殘基形成的邊對面 π-π 堆積1009 分別位于配體大 π 鍵的兩側(cè)，如圖 4-1 所示。因此，抑制的 Phe-914 殘基形成 π-π 堆積作用對其展現(xiàn) XO 抑制活性至關(guān)
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2862080