近年來,由于人們生活水平的提高,由食物過敏引起的食品安全問題日益受到消費者的重視。甲殼類水產(chǎn)品由于其味道鮮美、來源廣泛、營養(yǎng)經(jīng)濟價值高而受到廣大消費者的歡迎,但甲殼類水產(chǎn)品作為易引起食物過敏反應的八大類食品之一,含有多種致敏成分。原肌球蛋白作為甲殼類水產(chǎn)品最主要的過敏原之一,其結(jié)構(gòu)性質(zhì)穩(wěn)定,難以通過食品加工及烹飪過程消除其致敏原性。目前,除了避免過敏原攝入外沒有較好的治療食品過敏的方法,因此建立快速、準確地定量檢測食品過敏原方法日益受到學界的關注。目前,甲殼類原肌球蛋白的定量檢測方法主要為ELISA法和PCR法,但這兩類方法普遍存在前處理復雜、操作成本高、操作復雜、精確性低并且需要大量的孵育反應時間等一系列缺點。因此基于上述問題,本研究旨在研究出一種快速、準確的甲殼類原肌球蛋白超敏檢測方法。主要內(nèi)容如下:1、通過酶切重組法構(gòu)建刀額新對蝦原肌球蛋白表達載體質(zhì)粒pGEX4T-MBP-TROP-1O×His,并用熱激法將重組質(zhì)粒導入大腸桿菌BL21 E.coil中體外重組表達刀額新對蝦原肌球蛋白。通過Tev酶對重組原肌球蛋白進行修飾后經(jīng)Histrap HP親和層析柱對其進行純化,最終獲得高純度重組原肌球蛋白,經(jīng)高效液相層析色譜質(zhì)譜聯(lián)用鑒定該蛋白為Met e1(Metapenaeus ensis)分子量為32.8kD,BCA法測定其濃度最高可達1.8460 mg·tmL-1。通過間接性ELISA比較重組原肌球蛋白與通過丙酮粉-鹽析法得到的天然刀額新對蝦原肌球蛋白的致敏性。結(jié)果表明,兩種蛋白其致敏能力相似,且最適ELISA條件額為包被抗原濃度為0.5 μg·mL-1,最佳血清稀釋倍數(shù)為1000倍。2、通過檸檬酸鈉還原四氯金酸法制備金納米粒子,并用TEM、UV-vis、DLS對其進行理化表征,最終選用平均粒徑為33.82 nm的金納米粒子表面修飾抗原肌球蛋白單克隆抗體、21.04nm的金納米粒子表面修飾重組原肌球蛋白。以體積比4:1的比例混合金標抗體與金標抗原,最終組裝獲得組裝率90%以上的金納米粒子三聚體,通過UV-vis以及圓二色光譜對其進行光學性質(zhì)表征,組裝后的金納米粒子其紫外可見光吸收沒有顯著變化,但其在波長525 nm處產(chǎn)生顯著的手性吸收信號。3、本文通過游離原肌球蛋白與金納米粒子三聚體中金標原肌球蛋白競爭結(jié)合金標抗體的結(jié)合位點的方式定量檢測樣品中游離原肌球蛋白的含量,最終方法標準曲線回歸方程y =-4.607 In(x)+ 17.251,相關系數(shù)R2=0.9927,線性范圍為0-14ng·mL-1。方法的檢出限(limit of detection,LOD)為 21 pg·mL-1(S/N=3),定量限(limit of quantitation,LOQ)為70pg·mL-1(S/N=10),相比起傳統(tǒng)的ELISA的定量方法(LOD=90 pg·mL-1),金納米三聚體生物傳感器具有更高的靈敏度,并且極大的減少了檢測時間。4、本文提取了中國對蝦(Penaeus chinnsis)、凡納濱對蝦(Litopenaeus Vannamei)、刀額新對蝦(Metapenaeus ensis)、北極甜蝦(Pandallus boreali)、斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)、蝦姑(Oratosquillaoratoria)以及克氏原螯蝦(Procambarus clarkia)在內(nèi)的7種常見甲殼類水產(chǎn)品全蛋白浸提液,并通過金納米粒子三聚體傳感器與間接性ELISA對全蛋白浸提液中原肌球蛋白的含量進行定量分析。結(jié)果表明,兩種分析方法檢測結(jié)果相近,證明此方法具有較好的準確性。
【學位單位】：浙江工商大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：TP212.3;O657.1;TS254.7
【部分圖文】：

２．３實驗方法??２．３．１刀額新對虹原肌球蛋白體外表達載體質(zhì)粒的構(gòu)建??２．３．１．１試驗菌株感受態(tài)制備??（１）?Ｓｔｂｌ３?￡■．＜：〇／／感受態(tài)菌株制備??�。担�?｜ａＬ?Ｓｔｂ丨３?￡．？＞／／菌液用劃線法接種于ＬＢ瓊脂平板上，于３７?°Ｃ培養(yǎng)箱??中培養(yǎng)Ｉ６ｈ。取平板上單菌落于ＬＢ肉湯培養(yǎng)基中單克隆，于３７°Ｃ搖床中培養(yǎng)。??１６?ｈ后以菌液：ＬＢ肉湯培養(yǎng)基＝１：１００的比例將單克隆后菌液接入２００?ｍＬ新鮮??ＬＢ肉湯培養(yǎng)基中，于３７°Ｃ搖床中進行擴增（至ＯＤ＝０．２－０．５）。將擴增后菌液于??４?°Ｃ?３０００?ｇ離心丨０?ｍｉｎ，移去培養(yǎng)基，加入６０?ｍＬ預冷的０．１?ｍｏｌ．Ｌ－１氯化ｔ丐溶??２２??

在擴增過程中仍可能存在序列堿基突變、缺失或增加等影響最終蛋白表達結(jié)果的??因素，因此，將重組質(zhì)粒進行測序（生工生物工程（上海）有限公司），其測序??結(jié)果與原設計序列對比如圖２－５所示。??（６＾５）?ＢｓｓＨＩＩ?Ｔｓ〇Ｉ?（９１８）??（１４２）?Ｎｏｔｌ?（６３９）?ＰｆＩＦＩ?－?Ｔｔｈｌｌｌｌ?Ｈｉｎｄｉ?Ｈｐａｌ?（９３２）??（８４）?ＥｃｏＲＩ?（５２８）?ＦｓｐＩ?ＡｓｉＳＩ?（１００３）??（０）?Ｓｔａｒｔ?（２９９）?ＮｓｐＩ?（４４９）?ＡｃＩＩ?Ｅｎｄ?（１１００）??２５０＇?５００＇?７５０＇?１００Ｃ１??？?！■?Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?Ｐｒｏｔｅｉｎ?ＴＲＯＰ??Ｆａｃｔｏｒ?Ｘａ?ｓｉｔｅ??ＴＥＶ?ｓｉｔｅ?ＦＬＡＧ??圖２－５重組質(zhì)粒測序片段序列與設計序列對比圖??Ｆｉｇ．?２－５?Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ?ｆｒａｇｍｅｎｔ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ?ａｎｄ?ｄｅｓｉｇｎ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ?ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ??ｃｈａｒｔ??堿基的突變狀況與對表達出氨基酸的影響如表２－１３所示，重組后的質(zhì)粒在??測序段序列內(nèi)第９５１和９５７兩處堿基發(fā)生點突變，Ｍ終表達出的重組Ｋｉ肌球蛋Ａ??分別在２６８位氨基酸處由Ｌｙｓ突變?yōu)椋牵椋�、２７０位處氨基酸山ｌｉｅ突變�(yōu)椋蹋澹�，�??序列保守性仍達到了?９９．８％，Ｒ未出現(xiàn)因突變導致重組蛋白翻譯終止，ＩＬ應用子??純化、修飾、酶切的關鍵Ｔａｇ蛋白位點未發(fā)生突變

Ｆｉｇ．?２－７?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ??２．４．２．３重組蛋白濃度分析結(jié)果??通過ＢＣＡ法分析蛋白濃度，標準蛋白的標準曲線如圖２－７所示，每個樣品??重復３次，以標準蛋白濃度為Ｘ軸，吸光度Ａ５６２為Ｙ軸做標準蛋白濃度的標準??曲線。所得標注曲線ｙ＝ｌ．ｌ〇６６５ｘ＋０．１２５２５，相關系數(shù)Ｒ２＝０．９９９４６，純化后的重組??刀額新對奸原肌球蛋白Ｗ量為丨．８４６０?ｍｇ＇ｍＬ＇１。??０?Ｓ＇ｌ?ｙ＝?１．１０６６５ｘ?＾０．１２５２５??Ａ?＇?Ｒ２＝０．９９９４６??０．６－?■??３?０．?５?－?■?Ｚ?’??Ｉ－?■??＾?ｏ．?３?－??〇，：??０．?１?－??ｏ．?ｏ?－Ｉ?■?１?？?１???１???１???１??０．０?０？〗?０＿?２?０．３?０．４?０．５??標準蛋內(nèi)濃度）??圖２－８蛋白質(zhì)濃度標準曲線??Ｆｉｇ．?２－８?Ｔｈｅ?ｓｔａｎｄａｒｄ?ｃｕｒｖｅ?ｏｆ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ??２．４
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本文編號：2858466