背景:目前肺癌發(fā)病率高,腫瘤相關(guān)死亡率在全球位居第一,其中非小細胞肺癌(NSCLC)大約占肺癌患者的85%,是最常見的組織學類型。針對非小細胞肺癌的治療手段主要包括手術(shù)、放療和化療等,其中以鉑劑為主的化療方案是臨床上應(yīng)用的主要方案,但療效有限,僅能使Ⅲ、Ⅳ期患者死亡風險下降26-32%,患者中位生存期大概只有8-10個月。大部分NSCLC患者被診斷時已經(jīng)喪失了手術(shù)機會,5年生存率只有2%。近些年分子靶向治療取得了突飛猛進的發(fā)展,例如,吉非替尼(ZD1839,Iressa),一種EGFR酪氨酸激酶抑制劑(TKI),2003年獲FDA批準,可以阻斷EGFR下游信號的傳導,促使腫瘤萎縮,表現(xiàn)出良好的初始響應(yīng)及極好的抗癌作用。然而,腫瘤耐藥性的產(chǎn)生大大減弱了藥物療效,使用藥劑量明顯增加。而大劑量用藥又會導致正常細胞受到不同程度的傷害。因此,研發(fā)更加低毒、高效的抗NSCLC藥物、找到新的作用靶點具有重要的科學及臨床價值。人們探索蛋白質(zhì)活性已具有數(shù)百年的歷史。研究表明蛋白質(zhì)的生物有效性與其氨基酸含量、氨基酸序列及空間結(jié)構(gòu)等具有較大的相關(guān)性,研究發(fā)現(xiàn)藥用動、植物中存在著大量具有藥理活性的蛋白質(zhì)、多肽類物質(zhì),這些蛋白質(zhì)、多肽具有開發(fā)為抗癌藥物的巨大潛力�？喙鲜且环N具有苦味的植物果實,在中醫(yī)藥應(yīng)用中被廣泛用于治療各種疾病,如腫瘤、炎癥、糖尿病等�？喙咸崛∥镆驯蛔C實在治療腫瘤中發(fā)揮重要的作用,具有抗腫瘤細胞增殖和遷移的功效。然而,迄今為止,尚未有關(guān)于苦瓜活性肽用于癌癥治療的報道,有待進一步研究。目的:本研究將通過活性追蹤的方式分離、鑒定苦瓜活性肽并將其氨基酸序列進行鑒定分析,并研究其對非小細胞肺癌A549、L78、PGCL3、H460和NCI-H1299細胞株的抗增殖活性及其誘導A549細胞凋亡的作用機制。方法:1、苦瓜活性肽的分離及氨基酸序列采用硫酸銨分級沉淀(50%-80%飽和度)、超濾(截留分子質(zhì)量1kDa)和冷凍干燥技術(shù)獲得蛋白粗提物(組分Ⅰ)。將組分Ⅰ通過疏水色譜、陰離子交換色譜、凝膠色譜及反相高效液相色譜等方法獲得苦瓜活性肽。整個純化過程中采用280nm檢測苦瓜活性肽的洗脫情況并收集,采用MTT法檢測收集到的苦瓜活性肽的抗腫瘤細胞增殖活性。2、MTT細胞增殖實驗檢測肺癌細胞A549、L78、PGCL3、H460、NCI-H1299和正常肺纖維細胞CCD19增殖改變,分析MCL0-12對NSCLC細胞的選擇性殺傷作用。3、AnnexinV/PI雙染細胞凋亡檢測方法、凋亡檢測試劑盒檢測MCL0-12對A549細胞凋亡和細胞周期的影響。4、不同濃度MCL0-12處理A549細胞48h,線粒體膜電位檢測試劑盒、活性氧(ROS)試劑盒檢測A549細胞線粒體膜電位和細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的變化情況,Western blotting檢測促凋亡和抗凋亡蛋白的表達情況。結(jié)果:1、本研究共分離得到28種苦瓜活性肽,并解析了其氨基酸序列。其中,MCL0-12抗腫瘤活性最強,HPLC-ESI-MS質(zhì)譜結(jié)果表明其分子質(zhì)量為811.3761Da,氨基酸序列為FHGKGHE。2、苦瓜活性肽能顯著抑制NSCLC細胞的增殖,但是對正常肺纖維細胞則無增殖抑制作用;其中,MCL0-12對A549細胞增殖抑制活性最強,IC50值為21.4±2.21mM,對正常肺纖維細胞的IC50200mM。3、AnnexinV/PI雙染細胞凋亡結(jié)果顯示10.7、21.4、42.8mM MCLO-12能顯著誘導細胞凋亡,且以晚期細胞凋亡為主,濃度越大,晚期凋亡比例越高。細胞周期分析結(jié)果顯示MCL0-12能將A549細胞阻滯在GO/G1期。4、MCL0-12增加細胞內(nèi)ROS水平、誘導線粒體膜電位水平下降:MCL0-12處理A549細胞后,ROS顯著增加,且呈現(xiàn)劑量、時間依賴性。MCL0-12處理的A549細胞,線粒體膜電位顯著降低,其中,42.8mM MCL0-12處理后,其線粒體膜電位水平下降最為明顯。5、Western blotting 結(jié)果顯示 MCLO-12 通過調(diào)控 Caspase3、Caspase9 及PARP誘導細胞凋亡,這些酶與細胞死亡過程緊密相關(guān)。MCLO-12影響Trx系統(tǒng)及MAPK信號傳導通路:MCLO-12通過抑制TrX系統(tǒng),激活ASK1、MAPK通路增加胞內(nèi)ROS水平,最終誘導細胞凋亡。結(jié)論:1、MCLO-12對NSCLC細胞具有選擇性殺傷作用,能夠誘導細胞凋亡、阻滯細胞周期。2、MCLO-12通過線粒體通路誘導A549細胞凋亡,導致線粒體膜電位水平下降;另外,還能通過抑制TrX系統(tǒng)導致ROS蓄積,進而激活一系列由TrX介導的信號通路,包括ASK1,MAPK-p38及JNK等,誘導細胞凋亡。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R734.2;TS201.4
【部分圖文】：

凋亡的起點。Ｐ３８，作為ＭＡＰＫ通路的另一成員，當ＲＯＳ生成增加時也會參與凋亡??信號傳遞。Ｐ３８和ＪＮＫ都可被ＡＳＫ－１激活，后者的活性由它與硫氧還蛋白的相互??作用所控制［７＂：：］。圖１顯示了?ＲＯＳ發(fā)揮抗癌效應(yīng)時涉及的相關(guān)機制及通路［？。??提高ＲＯＳ水平更適合治療哪種類型的惡性腫瘤需要進一步研究，因為各種類型的??腫瘤特點不同，且治療反應(yīng)也不同。??１２??

研宄顯示，激活細胞的ＥＲＫ通路可以使凋亡減少，而ＪＮＫ及Ｐ３８ＭＡＰＫ通??路則會誘導死亡。ＥＲＫ與ＪＮＫ、ｐ３８ＭＡＰＫ之間保持著穩(wěn)定性，進而影響著細胞的??命運。圖２顯示了外界刺激通過線粒體內(nèi)源性途徑及激活ＥＲＫ／ＭＡＰＫ通路誘導凋亡??的分子機制［９４］。??１４??

結(jié)果??１．抗腫瘤蛋白鑒定??通過以上分離純化過程，流程圖見圖３，最終得到２８種抗腫瘤蛋白，通過??ＨＰＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ進行氨基酸序列分析及鑒定。在這個條件下，肽段經(jīng)常質(zhì)子化，因??為能量較低，肽段裂解經(jīng)常發(fā)生在酰胺鍵之間，而不是側(cè)鏈的化學鍵。因此，當??碰撞能量＜２〇〇ｅＶ，?ｂ和ｙ離子是主要裂解離子。我們通過ＨＰＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ對ＭＣＬ０－１２??進行了分子量測定及肽段特征分析，該組分的分子量為８１１．?３７６１Ｄａ?（見圖４）。??碎片離子?ｍ／ｚ?２８５．?１３２５?是?ｙ５?離子，ｍ／ｚ?４７０．?２４６１?是?ｂ３?離子，ｍ／ｚ?５２７．?２５８１??是?ｙ３?離子。ｍ／ｚ?７９３．?３７２９?是碎片離子［Ｍ－ＮＨ２＋Ｈ］＋，ｍ／ｚ?６６４．?３２５４?是?ｂｌ?離子�；�??于此，我們得出結(jié)論，ＭＣＬＯ－１２的氨基酸序列為ＦＨＧＫＧＨＥ，另外，通過ＭＳ／ＭＳ質(zhì)??譜分析
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本文編號：2849635