傳統(tǒng)免疫分析方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和免疫層析法(Immunochromatographic assay,ICA)兩大類。其中,ELISA采用辣根過氧化物酶(Horse radish peroxidase,HRP)催化有機(jī)底物四甲基聯(lián)苯胺(Tetramethyl benzidine,TMB)顯色作為免疫分析的信號源,而ICA則采用30-40 nm球形膠體金納米粒子(Gold nanoparticle,AuNP)為信號源。以上兩大類方法因信號輸出能力弱,導(dǎo)致檢測方法靈敏度總體偏低,介于μg/mL-ng/mL之間,難以滿足微量乃至痕量目標(biāo)分析物檢測的需求。提高上述兩類免疫分析方法的檢測靈敏度對于拓寬其應(yīng)用范圍具有重要的學(xué)術(shù)以及實際應(yīng)用價值�；诖�,本研究構(gòu)建了兩種改善傳統(tǒng)免疫分析方法檢測靈敏度的新型信號放大策略,具體內(nèi)容如下:(1)提高信號分子的負(fù)載量構(gòu)建高信號輸出能力得探針是提高免疫分析方法檢測靈敏度常用的策略之一。其中以納米粒子為載體負(fù)載酶可以在單個納米粒子上實現(xiàn)大量酶分子的固定化,因而可顯著提高ELISA檢測信號,實現(xiàn)待測物超靈敏檢測。本研究擬以多枝狀納米金(Gold nanoflower,AuNFs)為載體,通過在其表面修飾雙親性配體,利用AuNFs表面疏水腔分別大量負(fù)載四苯基卟啉鐵(FeTPPCl)及熒光素(Fluorescein)分子,以制備兩種高效的納米酶(AuNF@FeTPPCl和AuNF@Fluorescein)。利用FeTPPCl和Fluorescein的HRP模擬酶活性以及AuNFs的超強(qiáng)裝載能力,在傳統(tǒng)固相酶免疫學(xué)分析基礎(chǔ)上,分別構(gòu)建高靈敏檢測食品中伏馬毒素B_1(Fumonisin,FB_1)的直接競爭ELISA和血清中甲胎蛋白(Alpha fetoprotein,AFP)的雙抗體夾心ELISA。同時,采用Fluorescein的熒光發(fā)射作為免疫學(xué)信號輸出,進(jìn)一步構(gòu)建“比色-熒光”雙模式ELISA新方法,大大提高傳統(tǒng)單模式分析的準(zhǔn)確性。為此,本研究首先合成了氨基/羧基末端的雙親性鏈“巰基-壬烷-四甘醇-氨基/羧基”并借助Au-S鍵的強(qiáng)配位作用將其修飾于90 nm AuNFs表面,形成疏水腔。隨后通過疏水相互作用分別將FeTPPCl和Fluorescein負(fù)載于AuNFs的表面疏水腔中,形成AuNF@FeTPPCl和AuNF@Fluorescein納米酶。酶載量分析顯示,單個AuNF載體可分別負(fù)載2.4×10~6個FeTPPCl和3.67×10~6個Fluorescein;酶活性分析表明,FeTPPCl和Fluorescein的裝載和釋放對其HRP模擬酶活性沒有明顯影響,且該納米酶對底物H_2O_2和TMB的單位轉(zhuǎn)化數(shù)(Kcat)較傳統(tǒng)HRP提高了1-2數(shù)量級,有助于提高傳統(tǒng)ELISA的檢測靈敏度。此外,該納米酶還展現(xiàn)了更強(qiáng)的環(huán)境耐受性和長期保存穩(wěn)定性,大大改善了方法學(xué)的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。鑒于此,一方面以AuNF@FeTPPCl為載體偶聯(lián)牛血清白蛋白(Bovine serum albumen,BSA)和FB_1作為競爭抗原以構(gòu)建直接競爭ELISA實現(xiàn)FB_1定量檢測,在最優(yōu)條件下,其線性方程為y=-15.59ln(x)+123.84,R~2=0.9954,半數(shù)抑制濃度(50%inhibitory concentration,IC_(50))為101 pg/mL,較常規(guī)ELISA低250倍,進(jìn)一步將該方法應(yīng)用于檢測FB_1加標(biāo)的大米、玉米和小麥樣品,其回收率為87.9-110.8%,變異系數(shù)小于20%,表明該方法具有較好的準(zhǔn)確度,可用于實際樣本中FB_1的檢測;另一方面以AuNF@Fluorescein為載體,結(jié)合生物素-鏈霉親和素放大體系,建立了靈敏、準(zhǔn)確檢測甲胎蛋白(AFP)的“比色-熒光”雙模式夾心ELISA,在最優(yōu)條件下,采用比色檢測模式,其線性方程為y=2.0785x+109.8,檢測靈敏度為17.7 pg/mL,較常規(guī)ELISA高15倍,而采用熒光檢測模式,其線性方程為y=1.2924x+0.1117,檢測靈敏度低至29 fg/mL,較常規(guī)ELISA高9300倍,進(jìn)一步將該方法應(yīng)用于20個AFP加標(biāo)血清樣本的檢測,并將其檢測結(jié)果與商業(yè)化Abcam化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行對比,表明該方法兩種檢測模式下與試劑盒的檢測結(jié)果均有較高的線性相關(guān)性(相關(guān)系數(shù):比色為R~2=0.9856,熒光為R~2=0.9966),同時與血清中其他常見蛋白標(biāo)志物無明顯交叉反應(yīng),表明該“比色-熒光”雙模式ELISA適用于實際血清樣本中AFP的靈敏、準(zhǔn)確檢測。(2)提高AuNP探針的信號強(qiáng)度是改善免疫層析方法靈敏度的重要策略。金、銀信號生長增強(qiáng)策略通過在AuNP表面還原沉積金、銀納米殼層,誘導(dǎo)AuNP粒徑增大,因而可大大提高試紙條靈敏度。但該方法納米殼層的還原沉積嚴(yán)格依賴時間變化的生長模式,有著嚴(yán)格的操作要求,重現(xiàn)性差,且常產(chǎn)生非特異性背景信號。針對以上問題,本研究建立了聚乙烯亞胺(polyethyleneimine,PEI)為骨架,銅納米粒子可控生長增強(qiáng)AuNP-ICA檢測靈敏度新方法。在該模式下,AuNP探針通過PEI介導(dǎo)飽和吸附銅離子,隨后通過抗壞血酸鈉還原為單質(zhì)銅沉積于AuNP探針表面,增大其粒徑,顯著增強(qiáng)AuNP顯色信號強(qiáng)度。由于被吸附的銅離子量與檢測線上捕獲的AuNP探針數(shù)量呈現(xiàn)良好的劑量關(guān)系,因此該方法具有檢測靈敏度高、重現(xiàn)性好的特點。在最適條件下,將銅納米粒子可控生長的AuNP-ICA用于檢測牛奶中的大腸桿菌O157:H7,其檢測靈敏度為6CFU/mL,較放大前提高了三個數(shù)量級,且檢測時間少于20分鐘。進(jìn)一步利用該方法對17種常見的食源性致病菌進(jìn)行檢測,未見明顯交叉反應(yīng),表明該方法具有良好的特異性。通過對15個隨機(jī)加標(biāo)的牛奶樣進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示回收率介于84%-116%之間,變異系數(shù)均小于12%,表明該方法能夠用于大腸桿菌O157:H7的現(xiàn)場快速超靈敏定量篩查。
【學(xué)位單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：TS207.4
【部分圖文】：

Figure 3. Schematic of the the catalase based fluorescence ELISA for OTA detection.圖 3 基于過氧化氫酶熒光 ELISA 檢測 OTA 原理圖。1.2.4 適配新型信號輸出體系盡管制備高信號強(qiáng)度的納米探針提高免疫分析方法的檢測靈敏度展現(xiàn)了大的應(yīng)用前景，但是這些新興的技術(shù)往往無法與市場現(xiàn)有的技術(shù)平臺完全匹導(dǎo)致產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化效率偏低。例如：針對 HRP/堿性磷酸脂酶的保護(hù)劑不適用于基納米材料構(gòu)建的傳感器；納米材料的穩(wěn)定性依賴于其表面配體，無法凍干處等[72]。因此采用催化活性更高的酶取代 HRP 作為標(biāo)記物，并適配信號輸出能更強(qiáng)的底物作為信號源是提高傳統(tǒng)免疫分析方法靈敏度的有效策略。如圖 3示，Huang 等以過氧化氫酶作為標(biāo)記物，以過氧化氫敏感的量子點作為信號通過在過氧化氫酶上標(biāo)記抗原，建立直接競爭熒光 ELISA 超靈敏檢測糧食OTA 的新方法[4]。除了上述的熒光 ELISA 外，表面等離子共振 ELISA 也是過采用新型的等離子信號輸出體系提高免疫分析方法檢測靈敏度。早在 2

第 1 章 引言響應(yīng)型ELISA也是通過采用新型信號輸出體系提高免疫分析技術(shù)檢測靈敏度的策略之一[80]，其原理如圖 4 所示。以葡萄糖氧化酶/脲酶等能夠催化底物產(chǎn)酸或產(chǎn)堿的天然酶為標(biāo)記物，采用溴甲酚紫等 pH 敏感的指示劑作為信號源建立 pH響應(yīng)型 ELISA[81]。但是這類方法由于采用的 pH 指示劑過于敏感，且底物往往需要溶解在超純水等緩沖能力弱的緩沖液中，因而在實際應(yīng)用中操作難度較大，重現(xiàn)性低。

第 1 章 引言到 10-19M[91]。此外，由于金屬優(yōu)異的光學(xué)特性，因此金屬生長法也被開發(fā)應(yīng)用于信號增強(qiáng)，相較于上述增強(qiáng)策略，金屬生長法不需要對免疫學(xué)探針進(jìn)行額外的改造[92]。如圖 5 所示，在試紙條上完成第一輪免疫學(xué)反應(yīng)后，通過在試紙條檢測區(qū)域二次涌動、滴加或者浸泡等方式添加金屬生長液，在還原劑的作用下，金屬離子被還原成單質(zhì)并通過“負(fù)電位沉積效應(yīng)”沉積在膠體金表面進(jìn)而提高探針的信號強(qiáng)度[93]。目前常見的金屬生長策略主要包括金和銀兩種貴金屬的生長[94-99]。盡管金屬生長法不需要設(shè)計和合成復(fù)雜的納米材料或者開發(fā)高敏的信號輸出體系，但是該類方法需要后期添加增強(qiáng)液，這無形延長了檢測時間，因此不適用于對檢測時間要求嚴(yán)格的目標(biāo)物分析。此外，相對于傳統(tǒng)信號輸出模式，信號放大策略在常規(guī)免疫分析技術(shù)流程之外需要額外增加信號放大流程，因此有著更大的系統(tǒng)誤差。
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本文編號：2841131