食品生產(chǎn)過程中可能受到多重病原菌的污染,對消費者的健康造成嚴(yán)重威脅,快速檢測食品中的致病菌,對保障食品安全十分重要。然而食品中污染的病原菌通常數(shù)量較少,且食品成分中存在干擾性物質(zhì),影響檢測方法的靈敏度及特異性,因此,對食品中致病菌進(jìn)行分離或富集是十分重要的。磁性納米粒子(Magnetic Nanoparticles,MNPs)具有良好的生物相容性,而且容易分離,在食源性致病菌的分離和檢測方面受到青睞。本研究制備一種帶正電荷的氨基功能化磁性納米粒子(Amino functionalized magnetic nanoparticles,AF-MNPs),與負(fù)電荷的細(xì)菌間靜電相互作用,對細(xì)菌進(jìn)行富集,結(jié)合多重PCR法檢測食品中金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)和腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)。具體研究內(nèi)容和結(jié)果總結(jié)如下。1)AF-MNPs的制備及表征。通過化學(xué)共沉淀法制備Fe_3O_4 MNPs,表面修飾3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES),合成了表面攜帶正電荷的AF-MNPs,并進(jìn)行表征。結(jié)果表明制備的AF-MNPs呈球形或類球形,粒徑約為10 nm,電鏡下一定程度上有團(tuán)聚現(xiàn)象,納米粒度分析儀測定分散型指數(shù)(Polydispersity inde,PdI)為0.10±0.036,分散性良好,等電點在9.4左右,在pH 2-9其表面帶正電荷。2)AF-MNPs富集食源性致病菌。AF-MNPs對細(xì)菌的吸附捕獲主要是基于帶正電荷的MNPs和帶負(fù)電荷的細(xì)菌之間的靜電相互作用。以S.aureus、L.monocytogenes、S.enteritidis和大腸桿菌(Escherichia coli)為目標(biāo)菌株,研究AF-MNPs與細(xì)菌之間相互作用的影響因素,包括AF-MNPs、細(xì)菌和緩沖體系。結(jié)果表明,以100μg AF-MNPs與濃度為10~3 CFU/mL的細(xì)菌在PBS中溫育60 min,對S.aureus、E.coli、L.monocytogenes的捕獲率均高于97%,但對S.enteritidis的捕獲率低于40%;在pH 5-9 PBS(10 mmol/L)中,AF-MNPs對S.aureus和E.coli的捕獲率均大于80%,在pH 4-8 PBS(10 mmol/L)時,AF-MNPs對L.monocytogenes的捕獲率均大于75%;在PBS濃度為5-30 mmol/L范圍內(nèi)對S.aureus,L.monocytogenes,E.coli的捕獲率分別保持在75%、85%以及90%以上;在研究的4種細(xì)菌中,S.enteritidis的Zeta電位值最小,捕獲率最低;100μg的AF-MNPs對細(xì)菌濃度在10~2-10~6 CFU/mL的范圍內(nèi)捕獲率菌高于85%;在體積為10 mL的緩沖溶液中,對濃度為4 CFU/mL、40 CFU/mL和400 CFU/mL的細(xì)菌捕獲率超過90%。人工污染牛奶中,AF-MNPs對S.aureus,E.coli,L.monocytogenes和S.enteritidis的最高捕獲效率為分別為67.14%±1.33%、62.89%±0.68%、57.92%±2.93%和30.26%±0.69%;在人工污染的西瓜樣品中,AF-MNPs對于S.aureus、L.monocytogenes、E.coli和S.enteritidis的最高捕獲率分別為85.38%±0.63%、69.84%±2.97%、79.28%±0.90%和31.66%±3.30%。為了檢驗AF-MNPs的適用性,采集8種咸菜樣品和6種鹵肉樣品,AF-MNPs對咸菜食品中細(xì)菌的捕獲率均高于75%,對鹵肉樣品的捕獲率均高于65%。3)AF-MNPs富集結(jié)合多重PCR檢測食源性致病菌。以AF-MNPs富集結(jié)合多重PCR檢測人工污染牛奶中的S.aureus、L.monocytogenes和S.enteritidis。牛奶受到污染時,經(jīng)AF-MNPs富集的人工污染牛奶樣品中,S.aureus、S.enteritidis和L.monocytogenes的靈敏度分別為2 CFU/mL、2×10~2 CFU/mL和2 CFU/mL。而未經(jīng)AF-MNPs分別捕獲富集的人工污染牛奶樣品中,S.aureus、S.enteritidis和L.monocytogenes的靈敏度分別為2×10~2 CFU/mL、2×10~3 CFU/mL和2×10~3CFU/mL。將三種食源性致病菌進(jìn)行等濃度污染牛奶樣品,經(jīng)AF-MNPs富集結(jié)合多重PCR檢測,對S.aureus、L.monocytogenes和S.enteritidis的靈敏度為20CFU/mL、2×10~2 CFU/mL和2×10~2 CFU/mL,較直接進(jìn)行多重PCR,靈敏度分別提高100或1000倍,因此,AF-MNPs富集可以減少食品成分對檢測方法的干擾,有效提高多重PCR檢測的靈敏度。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：TB383.1;TS207.4
【部分圖文】：

氨基功能化磁性納米粒子富集結(jié)合多重 PCR 檢測食源性致病菌、核磁共振成像（Na et al 2009）、環(huán)境修復(fù)（Akbarzadeh et al 201離（姜源 等 2018）等領(lǐng)域（Ferreira et al 2016），氧化鐵 MNPs 在被廣泛應(yīng)用于從復(fù)雜樣品中快速、高效地磁分離富集細(xì)菌，作為細(xì)處理，如圖 1.1（Dinali et al 2017）。氧化鐵 MNPs 的廣泛應(yīng)用主要一些優(yōu)異的特點（Li et al 2013）：易于制備（Fe3O4可以通過簡單、模生產(chǎn)的水相共沉淀法來制備）；易于進(jìn)行表面改性（氧化鐵表面以方便地使用官能團(tuán)進(jìn)行改性修飾）；易于操作（由于具有超順磁的作用下，無需經(jīng)過離心或分離，即可從溶液中進(jìn)行回收磁顆粒）性（磁性粒子通�？梢灾貜�(fù)利用）；良好的分散性。

氨基功能化磁性納米粒子富集結(jié)合多重 PCR 檢測食源性致病菌的影響較大（pH、離子強(qiáng)度和生物分子濃度），因此科學(xué)研究者更價偶聯(lián)的方法對 MNPs 表面進(jìn)行修飾。共價偶聯(lián)是基于生物分子和價相互作用，通常有三種用于兩者間的偶聯(lián)方法：1）在納米顆粒上然后在聚合物涂層和生物功能分子之間形成共價鍵，該方法的主要物質(zhì)具有非特異性吸附因此，主要是通過以下兩種方法來制備；2）粒表面偶聯(lián)一層具有反應(yīng)基團(tuán)的分子，再與生物功能分子反應(yīng)（表面反應(yīng)的基團(tuán)首先與生物功能分子結(jié)合，然后，共軛物與納米顆路，如圖 1.2。

物質(zhì)具有非特異性吸附因此，主要是通過以下兩種方法來制備；2）粒表面偶聯(lián)一層具有反應(yīng)基團(tuán)的分子，再與生物功能分子反應(yīng)（表面反應(yīng)的基團(tuán)首先與生物功能分子結(jié)合，然后，共軛物與納米顆路，如圖 1.2。圖 1.2 將生物功能分子附著在納米顆粒上的兩種方法（Gu et al 2006）. 1.2 Two ways to attach biofunctional molecules to a nanoparticle（Gu et al 20的趨勢是在同一 MNPs 表面上應(yīng)用多種表面改性方法和/或幾種表面 1.3。
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本文編號：2841228