發(fā)布時間：2020-10-13 04:44

　　 Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白是骨骼肌肌內(nèi)結(jié)締組織的主要纖維性膠原蛋白,在動物的不同生長階段中其分布和特性有所變化,進而影響肌肉的嫩度。本研究采用自然放牧條件下的6、9、12、18月齡的烏珠穆沁羊,取其半腱肌和背最長肌,提取總RNA,采用實時熒光定量PCR方法對Ⅰ型膠原蛋白基因COL1A1、COL1A2和Ⅲ型膠原蛋白基因COL3A1在肌肉組織中的相對表達量進行了分析。并利用間接免疫熒光染色方法對Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白在骨骼肌肌內(nèi)結(jié)締組織中的分布狀態(tài)進行了分析。并從肌肉組織中提取了Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白,用SDS-PAGE方法和羥脯氨酸法對其進行了定性定量分析。建立了分離Ⅰ型膠原蛋白的雙向電泳方法。結(jié)果表明,在不同的月齡間,I型膠原蛋白基因COL1A1和COL1A2和Ⅲ型膠原蛋白的相對表達量在9、12月齡中相對較高。Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的含量隨著月齡的增長而顯著增加(p0.05),并且半腱肌肌內(nèi)結(jié)締組織中Ⅰ型膠原蛋白的含量顯著高于背最長肌(p0.05)。Ⅰ型膠原蛋主要分布在肌內(nèi)膜和肌束膜,Ⅲ型膠原蛋白主要分布在肌內(nèi)膜,少量分布在肌束膜。雙向電泳方法分離Ⅰ型膠原蛋白的電泳條件為上樣方式為水花上樣,第一向等電點聚焦時間為50000 V·h上樣量為640 μg/mL。
【學位單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：TS251.53
【部分圖文】：

圖１骨骼肌肌內(nèi)結(jié)締組織的解剖圖［％??Ｆｉｇ．?１?Ｔｈｅ?ａｎａｔｏｍｙ?ｏｆ?ＩＭＣＴ??）肌內(nèi)膜、肌束膜、肌外膜的分層圖（ｂ）朿狀肌表層肌纖維厚肌與肌內(nèi)肌間的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)屮的中？個肌原纖維（ｄ）圍繞蜂窩狀內(nèi)肌網(wǎng)的較厚的膜周圍的構(gòu)??圖?１?ａ?參考?Ｐｕｒｓｌｏｗ，２０１０；?Ｐａｇｅ：圖?ｄ?和?ｅ?參考?Ｐｕｒｓｌｏｗ?＆?Ｔｒｏｔｔｅｒ?（１９９４））??肌內(nèi)結(jié)締組織成分??織的含量、空間分布和組成隨肉的位置和動物年齡而細胞外基質(zhì)（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘ，ＥＣＭ）組成，肌纖由細絲（肌動蛋白）和粗絲（肌球蛋白）組成，細胞彈性蛋白、網(wǎng)狀蛋白、蛋白多糖和糖蛋白ｍ１，膠原蛋白，例如：在牛肉中占肌肉干重的１％－１５％、豬肉中占干質(zhì)量、禽肉中０．７５％－２％Ｍ，而彈性蛋白含量較少只有０．６％－３結(jié)締組織蛋白中研宄最少的一種，網(wǎng)狀蛋白由圍繞細

內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文試驗步驟??適量的膠原蛋白待測樣加入６ｍｏＬ／ＬＨＣｌ使其濃度為（５ｍｇ／ｍＬ）?充分水解。１６０００卬〇１，２５°（：離心２〇１１１丨１１。取上清液用１〇１＾［＾８范圍內(nèi)。蒸循水定容至８?ｍＬ，取上清液待測。�。�?ｍＬ待測液加室溫孵育２０?ｍｉｎ。ｌｍＬ?Ｅｈｒｌｉｃｈ’ｓ?Ｒｅａｇｅｎｔ溶液室溫放置５?ｍｉｎ。充鍋內(nèi)孵育２０?ｍｉｎ。冷卻在５６０?ｎｍ測吸光度。膠原蛋白含量＝羥脯氨１羥脯氨酸標準曲線的制作??配置１５?ｍｇ／ｍＬ羥脯氨酸標準溶液，然后將標準溶稀釋為１５、７．５９３８、０．４６９、０．２３４、０．１１７?（ａｇ／ｍＬ?標準溶液。各取?２?ｍＬ?待測液加，室溫鮮育２０?ｍｉｎ。ｌｍＬ?Ｅｈｒｌｉｃｈ’ｓ?Ｒｅａｇｅｎｔ溶液。充分混合后６０??ｍｉｎ。冷卻在５６０?ｎｍ處測吸光度，以吸光度為ｙ軸經(jīng)脯氨酸濃曲如圖所示。??

圖３?ＲＮＡ瓊脂糖凝膠電泳圖??Ｆｉｇ．３?Ｔｈｅ?ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｏｆ?ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ??不同月烏珠穆沁羊背最長肌和半腱肌內(nèi)提取ＲＮＡ的結(jié)果如圖３所示。紫外分??光光度計測定總ＲＮＡ濃度及ＯＤ２６〇／２？）值，然后在１．５％瓊脂糖凝膠電泳證實。電泳??檢測的結(jié)果顯示２８Ｓ、１８Ｓ條清晰，沒有其它雜條帶，說明ＲＮＡ沒有被降解，紫外??分光光度計檢測濃度及ＯＤ２６〇／２８Ｇ值結(jié)果見附錄，ＯＤ２６Ｇ／２８〇值均在１．８－２．０之間�？�??用于ｃＤＮＡ的合成和實時熒光定量ＰＣＲ試驗。??４．?１．２實時熒光定量ＰＧＲ擴增產(chǎn)物的鑒定??圖４目的基因和內(nèi)參基因的ＰＣＲ擴增產(chǎn)物??Ｆｉｇ．４?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ｔａｒｇｅｔ?ｇｅｎｅ?ａｎｄ?ｉｎｔｅｒｎａｌ?ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ?ｇｅｎｅ??注：圖?Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ?分別表示?ｐ－ａｃｔｉｎ、Ｃ０Ｌ１Ａ１、Ｃ０Ｌ１Ａ２、Ｃ０Ｌ３Ａ１，?Ｍ?表示?Ｍａｒｋｅｒ??
【參考文獻】

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本文編號：2838746