食品蛋白是無毒、營養(yǎng)豐富、易消化、易獲取和農(nóng)業(yè)可持續(xù)的人體營養(yǎng)攝入的關鍵蛋白質(zhì),每天由飲食攝取的食物蛋白質(zhì)對人體健康有著十分重要的作用,常見的食物蛋白主要有四種來源:(1)動物來源(2)植物來源(3)大型藻類來源(4)微生物來源。食品蛋白質(zhì)的結構在食品加工(即熱加工和非熱加工)或儲存過程(即低溫保存)中可能發(fā)生變化,這對蛋白在體內(nèi)的生物利用率、代謝和營養(yǎng)能力等都有一定的影響。因此,研究食品蛋白的結構特征及其在不同原料制備、加工或保存過程中的變化對更好利用食品蛋白是十分必要的。原子力顯微鏡作為一種重要的納米技術工具在食品蛋白研究中有著廣泛的應用,其中高度成像是研究食品蛋白最常用的方法。本課題以食源性蛋白中的膠原蛋白、玉米醇溶蛋白為主要研究對象,運用原子力顯微鏡從納米尺度到微米尺度對其進行了相關研究,具體開展了如下工作:(1)采用醋酸法、熱水法和氫氧化鈉法三種提取方式從羅非魚皮中提取膠原蛋白,基于濕魚皮的質(zhì)量,三種提取方式膠原蛋白產(chǎn)量為:醋酸法(11.7%)熱水法(10.7%)氫氧化鈉法(8.5%),基于魚皮中初始膠原蛋白含量21.89g/100g蛋白產(chǎn)率分別為:醋酸法(53.4%)、熱水法(48.9%)、氫氧化鈉法(38.8%)。運用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對三種提取方式膠原進行分子量的測定得:三種提取方式膠原蛋白分子量不同,且氫氧化鈉法提取的膠原分子大多是水解的;衰減全反射-傅立葉變換紅外光譜(ATR-FTIR)結果顯示三種提取方式的膠原蛋白具有相似的分子結構。(2)對醋酸法提取的羅非魚皮膠原蛋白(TSC)、I型牛肌腱(BFTC)和小鼠尾膠原蛋白(RTC)進行多態(tài)性和穩(wěn)定性的研究,運用SDS-PAGE電泳對同一濃度不同上樣量和不同濃度同一上樣量的三種膠原研究得出:濃度相同不同上樣量的三種膠原蛋白條帶強度有明顯差異,而對是否能夠跑出蛋白條帶無明顯影響;濃度不同上樣量相同時,蛋白濃度的大小對是否能夠跑出蛋白條帶有顯著影響。運用ATR-FTIR光譜對不同熱處理時間(0、7、14、21、28d)后波段范圍在1600-1700cm~(-1)三種膠原蛋白二級結構分析得BFTC二級結構隨時間變化不明顯,而RTC和TSC兩種膠原則隨時間變化明顯。運用原子力顯微鏡(AFM)對不同濃度下三種膠原蛋白的多態(tài)性進行觀察,得納米結構的形成具有一定的濃度依賴性。將濃度為0.4mg/mL的三種膠原蛋白液,在37℃條件下恒溫孵育不同時間(0、7、14、21和28d)對蛋白結構穩(wěn)定性進行研究得:BFTC在孵育過程中納米纖維轉(zhuǎn)化為左旋螺納米纖維,然后再轉(zhuǎn)化為納米顆粒;RTC納米結構由原纖維、納米顆粒和無序聚集物轉(zhuǎn)化為納米顆粒和原纖維;TSC納米結構的納米絲、納米顆粒和無序聚集物結構則轉(zhuǎn)化為納米顆粒和原絲。(3)采用玉米醇溶蛋白進行蛋白帶狀膜/纖維膜的制備,運用普通光學顯微鏡進行成膜濃度的確定得,濃度為35%時能夠制備得到大量長納米帶,且?guī)缀鯖]有納米微粒的存在。因此,可用于納米帶/纖維膜的制備。運用掃描電鏡(SEM)確定帶狀/纖維膜的成功制備,并用AFM對制備的膜進行截面分析,進一步確定蛋白膜的形狀。然后,將制備得到的帶狀/纖維膜用于Fe~(3+)的檢測實驗,發(fā)現(xiàn)載姜黃素玉米醇溶蛋白帶狀膜能夠更迅速,更高效的用于Fe~(3+)檢測實驗,且可用于飲用水中Fe~(3+)含量的檢測,檢測溫度對Fe~(3+)的快速檢測有明顯影響,制備的這些納米帶狀膜具有良好的儲存穩(wěn)定性。從而為蛋白帶狀膜的制備和其在實際生產(chǎn)當中的應用提供了指導,相信這也將在材料、環(huán)境和食品科學等科學和工程領域引起越來越多的關注。
【學位單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：TS201.21
【部分圖文】：

圖 1-1 膠原酶降解膠原纖維的高速 AFM 原位成像(a)該過程的高度圖像序列。標記 C 和 N的實線表示膠原纖維的極性。帶有線條的綠色圓圈代表膠原蛋白上的單個膠原酶分子。時間表示添加膠原酶后經(jīng)過的時間。Bar 為 50 nm; (b) (a)中突出區(qū)域的波動曲線記錄儀，（c）對應于（a，b）中標記的纖維數(shù)量相對應的單個最小纖維厚度的時間進程，虛線框的（藍色）或（綠色）對應與（a）中單個纖維上的膠原酶累積運行長度；（d）連續(xù)的高速 AFM 原位高度圖像，顯示了在膠原酶分子(圓形)作用下，最小原纖維(箭頭)的消失。Bar 為 20nm；掃描速率均為 0.3秒/幀；所有的 z-標度都是 5nm。經(jīng)引用許可轉(zhuǎn)載自參考文獻（Watanabe Nakayama 等人，2016）Fig 1-1 In situ high speedAFM imaging of minimal collagen fibril degradation by collagenase.(a) Height image sequence of this process. The solid line with labels of C and N indicated collagenfibril polarity. Green circles with lines represent individual Collagenase molecules on collagen. Thetimes indicated the elapsed times after the addition of collagenase. Bar was 50 nm; (b) Kymographfor the region highlighted in (a). (c) Time courses of thicknesses of individual minimal fibrilscorresponding to the number-labed fibrils in (a,b), with accumulated collagenase run length onindividual fibrils within (blue) or including the outside (green) of the dashed-line box in (a). (d)Successive in situ high speedAFM height images of disappearance of a minimal fibril (arrowhead)

圖 1-3AFM 對蛋糕中麥醇溶蛋白和谷蛋白的觀察；（a）麥醇溶蛋白聚集體的 AFM 圖像；（b）麥醇溶蛋白聚集體的大小分布，在每個尺寸范圍內(nèi)，字母不同的組有顯著差異（P<0.05）；(c)傳統(tǒng)蛋糕和無蛋蛋糕中谷蛋白的多孔結構（d）SPI + 0.1％XN（e）SPI + 1％MDG（f）SPI +1％SL（g）SPI + 0.1％XN + 1％MDG（h）SPI + 0.1％XN + 1％SL；SPI-大豆分離蛋白；XN-黃原膠；MDG-單甘油酯；SL-大豆卵磷脂。經(jīng)引用許可轉(zhuǎn)載（Lin,et al.2017b）（版權所有 2017愛思唯爾出版社）Fig 1.3 AFM observation of gliadin and glutenin in cakes. (a) AFM image of gliadin aggregates;(b) Size distribution of gliadin aggregates. Within each size range, groups with different letters aresignificantly different (P < 0.05). Porous structures of glutenin in (c) traditional cake and egglesscakes with (d) SPI + 0.1% XN, (e) SPI + 1% MDG, (f) SPI + 1% SL, (g) SPI + 0.1% XN + 1% MDG,(h) SPI + 0.1% XN + 1% SL. SPI  soy protein isolate; XN  xanthan gum; MDG  mono,diglycerides; SL  soy lecithin. Reprinted with permission of reference. (Copyright 2017 ElsevierPublisher)AFM 結果表明，蛋糕配方主要包含了麩朊聚集體，其直徑范圍在 100-200nm，

圖 1-4 純?nèi)榍宸蛛x蛋白膜(A, B)和乳清分離蛋白-玉米醇溶蛋白納米顆粒膜的 AFM 相位成像。經(jīng)引用許可轉(zhuǎn)載（版權所有 2016 愛思唯爾出版社）Fig 1-4AFM phase images of pure WPI film (A, B) and WPI-zein nanoparticle film (C, D).Adapted with permission of reference. (Copyright 2016 Elsevier Publisher)1.6.4 食品蛋白加工及保存效果研究了解不同加工和保存條件對食品蛋白的影響，對于開發(fā)食品加工和保存的新技術、新方法具有重要意義。AFM 可用于加熱、冷凍干燥、高壓等不同物理處理條件下食品蛋白質(zhì)的觀察。為驗證乳糖糖基化乳清分離蛋白膜的分散性，圖 5 是Liu 等人[28]在 pH3-7 條件下，運用 AFM 輕敲模式對加熱前后乳糖糖化的乳清分離蛋白膜進行的研究，高度圖像顯示了其分散的納米結構，在 pH4-6 條件下加熱后的樣品比 pH3 和 pH7 條件下的樣品更粗、更大。該研究證明 AFM 納米成像可用于分析復雜加工條件對食品蛋白質(zhì)的影響。朱等運用 AFM 研究了大豆分離蛋白（SPI）和乳清蛋白的熱誘導聚集，結果表明熱可以誘導納米粒子的形成，此外，熱誘導的大豆分離蛋白納米顆粒的粒徑比乳清蛋白大。運用 AFM 觀察大豆分離蛋白（SPI）在液氮冷凍和冷凍干燥后的變化，發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白膜表面光滑，空腔

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