鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)是一種重要的益生菌,具有保持腸道微生態(tài)平衡,抑制有害細(xì)菌生長,消除過敏等生理功能,是目前被應(yīng)用最為廣泛的乳酸菌之一。目前含有鼠李糖乳桿菌的制品種類繁多,但由于設(shè)備條件和技術(shù)水平千差萬別,導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊,許多產(chǎn)品存在活菌數(shù)不達(dá)標(biāo)、種屬標(biāo)識(shí)不符等質(zhì)量問題。因此建立快速、靈敏、精確的鼠李糖乳桿菌定量檢測方法對(duì)評(píng)價(jià)益生菌產(chǎn)品質(zhì)量、篩選理想菌株均具有重要意義。本論文圍繞鼠李糖乳桿菌的快速定量檢測,開展了以下幾方面的工作。(1)通過LGG菌毛亞基SpaA制備抗體偶聯(lián)免疫磁珠,通過辣根過氧化物酶放大信號(hào),建立了一種免疫磁珠電化學(xué)傳感器檢測鼠李糖乳桿菌的方法。結(jié)果表明,在優(yōu)化的最佳抗體濃度、磁珠用量、免疫時(shí)間和溫度下建立了標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,線性范圍為2.56×103-2.56×107CFU/mL,最低檢測限為22CFU/mL。該方法與干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌、植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、保加利亞乳桿菌及嗜熱鏈球菌均無交叉反應(yīng),說明該傳感器具有良好的特異性。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:5個(gè)樣本相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于5%重復(fù)性較好;穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,7 d后檢測發(fā)現(xiàn)電流值相對(duì)于初始值下降了 2.07%,14 d和21 d后分別下降了 5.07%和9.91%,整個(gè)檢測過程中表現(xiàn)出了良好的穩(wěn)定性。牛奶模擬樣品實(shí)驗(yàn)中回收率在91.74%-108.67%,RSD在2.72%-5.16%之間,表明該傳感器能準(zhǔn)確有效的檢測鼠李糖乳桿菌,且整個(gè)檢測過程不超過3 h。(2)以檸檬酸為碳源,乙二胺為表面鈍化劑利用微波法合成了藍(lán)色熒光的碳量子點(diǎn),研究了其表面形態(tài)及熒光性質(zhì)。通過共價(jià)交聯(lián)的方法將合成的碳量子點(diǎn)標(biāo)記SpaA抗體,特異性結(jié)合鼠李糖乳桿菌后通過熒光分光光度計(jì)測定其熒光強(qiáng)度來進(jìn)行定量檢測。結(jié)果顯示,合成的碳量子點(diǎn)尺寸均一、分散性好,最佳激發(fā)波長為350nm,熒光強(qiáng)度不受K+,Na+的影響,在pH4-11之間熒光強(qiáng)度相對(duì)穩(wěn)定,適合用于微生物檢測。在優(yōu)化最佳檢測條件下建立了標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,線性范圍為5×104-5×108CFU/mL,最低檢測限為103CFU/mL。同時(shí)也考慮了該方法的特異性并與菌落免疫印跡及流式細(xì)胞術(shù)檢測進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果表明,該方法與鼠李糖乳桿菌Bm01、LYO、BG均無交叉反應(yīng),鼠李糖乳桿菌LV108和CRL1505有一定的陽性信號(hào)但顯著低于LGG的熒光強(qiáng)度,與落免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致,表明了該方法具有良好的特異性。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)中將碳量子點(diǎn)(CDs)與傳統(tǒng)染料(異硫氰酸熒光素)FITC進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果基本一致,但CDs具有耐光漂白、低細(xì)胞毒性、良好的生物相容性且成本低廉、操作簡便等特性,為微生物檢測提供了一種新穎綠色的工具。(3)為篩選廉價(jià)的鼠李糖乳桿菌特異性識(shí)別元件,以鼠李糖乳桿菌LGG為宿主菌,從糞便樣品中分離得到鼠李糖乳桿菌噬菌體,命名為LRPYZU021。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),LRPYZU021噬菌體形態(tài)為長尾噬菌體科,裂解譜試驗(yàn)顯示噬菌體LRPYZU021只能裂解其宿主菌LGG,無法裂解其他5種鼠李糖乳桿菌,體現(xiàn)了該噬菌體極好的特異性。研究了噬菌體的基礎(chǔ)生物學(xué)特性。結(jié)果表明,噬菌體LRPYZU021在pH 6.0-11.0下穩(wěn)定性較好;在50℃及以下的溫度條件下,耐受性較好,對(duì)噬菌體進(jìn)行最佳感染復(fù)數(shù)、一步生長曲線、抑菌能力的測定,為進(jìn)一步利用鼠李糖乳桿菌噬菌體作為檢測特異性元件提供了新型材料。(4)將碳量子點(diǎn)標(biāo)記鼠李糖乳桿菌噬菌體LRPYZU021,研究其標(biāo)記效率以及標(biāo)記好的噬菌體在存儲(chǔ)過程中的活性和熒光強(qiáng)度的變化。結(jié)果表明,碳量子點(diǎn)標(biāo)記噬菌體后噬菌體存活率為82.42±4.72%,108PFU/mL濃度的噬菌體標(biāo)記后有較強(qiáng)的熒光,體現(xiàn)了該方法良好的標(biāo)記效率。儲(chǔ)存過程中噬菌體活性在5d內(nèi)無顯著降低,熒光強(qiáng)度在儲(chǔ)存過程中保持穩(wěn)定。將標(biāo)記后的噬菌體特異性的吸附鼠李糖乳桿菌后通過熒光分光光度計(jì)測定其熒光強(qiáng)度以此來檢測鼠李糖乳桿菌,同時(shí)也考慮了該方法的特異性,并與流式細(xì)胞術(shù)檢測進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果表明,當(dāng)細(xì)菌濃度為107CFU/mL以下時(shí)熒光強(qiáng)度不明顯,這可能由于CDs結(jié)合噬菌體效率低以及噬菌體誘導(dǎo)細(xì)胞裂解可能會(huì)阻礙量子點(diǎn)和噬菌體之間的相互作用;特異性表明該方法與Bm01、LYO、BG、LV108和CRL1505均無交叉反應(yīng),表明了該噬菌體相較抗體具有更好的特異性,為微生物檢測提供了一種新穎綠色,特異性極好的方法。
【學(xué)位單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：TS207.3
【部分圖文】：

Ｓｉｍ等ｔ６５］首次將通過？￡０１５0＿純化的碳點(diǎn)引入細(xì)胞成像系統(tǒng)，應(yīng)用于大腸桿菌共聚焦成像。逡逑Ｃａｏ等網(wǎng)用ＰＰＥＩ－ＥＩ修飾碳點(diǎn)使其具有雙光子熒光特性，并成功觀察到碳量子點(diǎn)進(jìn)入ＭＣＦ－逡逑７細(xì)胞（圖１－１）內(nèi)部，說明碳量子點(diǎn)優(yōu)秀的細(xì)胞成像功能。逡逑ＩＨＩＭｉ逡逑圖Ｍ碳量子點(diǎn)用于ＭＣＦ－７細(xì)胞成像圖［８０］逡逑Ｆｉｇｌ－１邋Ｔｗｏ－ｐｈｏｔｏｎ邋ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ邋ｉｍａｇｅ邋ｏｆ邋ＭＣＦ－７邋ｃｅｌｌｓ邋ｗｉｔｈ邋ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｄ邋Ｃ－Ｄｏｔｓ逡逑除了細(xì)胞成像外，ＣＤｓ由于其本身無毒的性質(zhì)也被大量的用于活體研宄來示蹤傳輸循逡逑環(huán)機(jī)理。Ｙａｎｇ等Ｍ將ＰＥＧ純化的碳量子點(diǎn)和摻雜硫化鋅的碳量子點(diǎn)注入小鼠體內(nèi)，如圖逡逑１－２實(shí)驗(yàn)者將制備的碳點(diǎn)皮內(nèi)注入到老鼠體內(nèi)，隨著時(shí)間的推移ＣＤｓ慢慢遷移至腋下淋巴逡逑結(jié)，然后將組織切片檢測到了其在體內(nèi)的熒光。逡逑Ｈ邋■醒逡逑圖１－２小鼠腋下肌肉注射摻雜硫化鋅碳點(diǎn)后在淋巴管中徖移圖［８１］逡逑Ｆｉｇ邋１－２邋Ｉｎｔｅｒｄｅｒｍａｌ邋ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＣＺｎＳ－Ｄｏｔｓ邋ｉｍａｇｅｓ逡逑

信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)的監(jiān)控和跟蹤藥物。Ｋｉｍ等用ＣＤｓ與金納米粒子表面的ＰＥＩ與ｐＤＮＡ交逡逑聯(lián)，交聯(lián)后碳點(diǎn)的熒光被ｐＤＮＡ猝滅。然后將交聯(lián)體導(dǎo)入細(xì)胞，在紫外光照射Ｆ釋放ｐＤＮＡ，逡逑碳點(diǎn)的熒光恢復(fù)，通過監(jiān)測釋放后的ｐＤＮＡ，達(dá)到藥物傳輸?shù)哪康模▓D１－３）。碳量子點(diǎn)不逡逑儀是出色的藥物載體，同時(shí)也是能量供體，此外不需要額外的熒光標(biāo)記物，生物相容性好，逡逑能有效的將藥物運(yùn)送到癌細(xì)胞中。逡逑ＣＤ－ＰＥＩ邐ｆ邐＾邋Ａ？ｔｏｃｉａｌ？ｏｎ邋＾邐＼邋＼逡逑＋邋＾ｅ＝２ｃ＾（邋－ＶＶ））逡逑－５邐ｃＤ＝ｅ＝ｒＮＡＸ＼逡逑Ａｕ－ＰＥｌ邐－邐Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ逡逑Ｃｅｌｌ邐＆邋＊邋＊邋＊邋＾．邋Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ邋ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ逡逑４６５邋ｎｍ邋Ｒｅｃｏｖｅｒｙ邋0ｆ邋ｃｅｌｌｕｌａｒ邋ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ逡逑圖ｌ－３ＣＤ－ＰＥＩ／Ａｕ－ＰＥＩ／ｐＤＮＡ組裝體用于基因傳送和細(xì)胞運(yùn)輸實(shí)時(shí)監(jiān)測丨８３】逡逑Ｆｉｇ邋１－３邋ＣＤ－ＰＥＩ／Ａｕ－ＰＥＩ／ｐＤＮＡ邋ａｓｓｅｍｂｌｙ邋ｆｏｒ邋ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ邋ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ邋ｏｆ邋ｇｅｎｅ邋ｄｅｌｉｖｅｒｙ邋ａｎｄ邋ｃｅｌｌ邋ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ逡逑１．４．２．３分析檢測逡逑碳量子點(diǎn)的熒光性質(zhì)受表面官能團(tuán)的影響，能和多種金屬離子及分子相互作用。碳納逡逑米粒子探針的構(gòu)建主要依靠其熒光猝滅或增強(qiáng)來實(shí)現(xiàn)，而電子轉(zhuǎn)移、動(dòng)態(tài)碰撞及復(fù)合物或逡逑絡(luò)合物的形成都可能導(dǎo)致碳納米粒子的熒光發(fā)生猝滅或增強(qiáng)＠１。熒光碳納米粒子用于檢測逡逑金屬離子和小分子的優(yōu)點(diǎn)是用量少、反應(yīng)靈敏、結(jié)果可靠、檢出限低、線性范圍寬

２．３．２免疫磁珠的表征逡逑２．３．２．１焚光表征逡逑如圖２－２所示，圖Ａ為偶聯(lián)ＳｐａＡ多抗磁珠，通過熒光顯微鏡觀察，藍(lán)色激發(fā)光下產(chǎn)逡逑生綠色熒光。圖Ｂ為對(duì)照組不產(chǎn)生綠色熒光。結(jié)果表明ＳｐａＡ多抗成功功能化于磁珠表面。逡逑ｍｍ逡逑圖２－２磁珠的熒光圖片逡逑Ｆｉｇ２－２邋Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ邋ｉｍａｇｅ邋ｏｆ邋ＭＢｓ逡逑Ａ：邋ＭＢｓ－Ａｂ－ＳｐａＡ；邋Ｂ：邋ＭＢｓ逡逑２．３．２．２紅外表征逡逑如圖２－３所示，曲線ａ中，５８４邋ｃｍ－１處對(duì)應(yīng)有吸收峰，是Ｆｅ－０鍵的特征峰。曲線ａ中逡逑１７００－１５７５邋ｃｍ－１、１４６０－１４２０邋ｃｍ－１有兩個(gè)特征峰，分別對(duì)應(yīng)為Ｃ＝０、－０Ｈ的特征吸收峰，證逡逑明該磁珠為羧基化磁珠。曲線ｂ中，１６９０－１６３０ＣＨＴ１處對(duì)應(yīng)有酰胺鍵的吸收峰存在，紅外光逡逑譜結(jié)果表明抗體成功偶聯(lián)于磁珠表面［９４］。逡逑

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 羅素賢;葉昱;周信榮;陳燕君;宋德平;彭棋;唐玉新;;一株鼠李糖乳桿菌的培養(yǎng)條件優(yōu)化研究[J];江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2018年02期

2 杜元軍;邱慧玲;朱連勤;李佳s

本文編號(hào)：2811010