【摘要】：抗生素在畜牧養(yǎng)殖中使用廣泛,存在過度使用情況,導(dǎo)致食品中(比如乳制品)存在抗生素殘留,其中β-內(nèi)酰胺類抗生素是最常見的,其可對人體健康和環(huán)境構(gòu)成威脅。目前經(jīng)常使用的抗生素殘留檢測方式具有一定的局限性,因而研究一種更為有效的檢測方法極為重要。近年來生物傳感器因其高靈敏度、響應(yīng)迅速等優(yōu)點,已成為一種重要的檢測工具。金屬改性介孔碳材料由于具有比表面積高、電催化性能優(yōu)良等優(yōu)點而廣泛用于傳感器性能的提高。亞甲基藍(MB)具有高度共軛的環(huán)狀結(jié)構(gòu)和優(yōu)異的電活性,可在電極表面形成具有導(dǎo)電性能的聚合物半導(dǎo)體薄膜,已廣泛用于電極改性。青霉素酶(Pen X)和新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶-1(NDM-1)均屬于β-內(nèi)酰胺酶,能夠水解β-內(nèi)酰胺類抗生素中的β-內(nèi)酰胺環(huán)從而導(dǎo)致抗生素水解失活。尤其是NDM-1能夠催化水解除氨曲南外的所有β-內(nèi)酰胺類抗生素,且目前在電化學檢測方面應(yīng)用較少。鑒于此,本文合成了金屬改性介孔碳材料,并基于Pen X和NDM-1設(shè)計了三種生物傳感器,完成了對β-內(nèi)酰胺類抗生素模型青霉素鈉(Pen G)和氨芐青霉素鈉(AMP)的檢測。1.兩種金屬基介孔碳材料的制備及性質(zhì)探究利用自組裝法和浸漬法制備鈷摻雜介孔碳材料(Co@C)和硫化鈷摻雜介孔碳材料(CoS_2@C),并對其羧基功能化得到COOH-Co@C和COOH-CoS_2@C。經(jīng)由掃描電鏡(SEM)、透射電鏡(TEM)、X-射線衍射光譜(XRD)、氮氣吸附脫附、傅里葉紅外光譜(FTIR)和X-射線光電子能譜(XPS)等儀器表征,實現(xiàn)對所制備的Co@C和CoS_2@C材料的性質(zhì)研究。結(jié)果表明Co@C和CoS_2@C穩(wěn)定性良好、具備孔結(jié)構(gòu),且成功的進行了羧基改性。2.青霉素酶生物傳感器的制備及應(yīng)用利用共價結(jié)合法將Pen X固定在羧基功能化的介孔碳載體上得到Pen X-COOH-Co@C和Pen X-COOH-CoS_2@C。將MB電聚合到玻碳電極(GCE)上得到PMB/GCE,再利用固定化酶材料進一步修飾改性電極得到Pen X-COOH-Co@C/PMB/GCE和Pen X-COOH-CoS_2@C/PMB/GCE生物傳感器。經(jīng)過實驗條件的優(yōu)化,以Pen G為抗生素模型利用差分脈沖伏安法(DPV)進行檢測,結(jié)果顯示Pen X-COOH-Co@C/PMB/GCE在Pen G濃度為0.1-10 ng·mL~(-1)時響應(yīng)峰電流與Pen G濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,線性方程為y=0.3811x+17.20(r~2=0.9974);在濃度范圍為10-100 ng·mL~(-1)時兩者也呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,線性方程為y=0.1170x+19.73(r~2=0.9959)。經(jīng)計算,Pen X-COOH-Co@C/PMB/GCE對Pen G的檢測限為0.64 ng·mL~(-1)(ppb)。在Pen X-COOH-CoS_2@C/PMB/GCE傳感器中,響應(yīng)峰電流在Pen G濃度為0.1-10 ng·mL~(-1)時呈現(xiàn)線性關(guān)系,線性方程為y=0.5642 x+21.57(r~2=0.9907);Pen G濃度為20-100 ng·mL~(-1)時也呈現(xiàn)線性關(guān)系,線性方程為y=0.0904x+25.91(r~2=0.9941),檢測限為0.61 ng·mL~(-1)(ppb)。并利用兩種傳感器采用加標法成功實現(xiàn)了牛奶樣品中Pen G的檢測。3.NDM-1生物傳感器的制備及應(yīng)用將MB電聚合到GCE上得到PMB/GCE;將NDM-1與戊二醛(GA)混合滴加到PMB/GCE上制備得到NDM-1/PMB/GCE工作電極。經(jīng)過實驗條件優(yōu)化,以Pen G和AMP為抗生素模型,利用DPV方法進行檢測。結(jié)果表明在Pen G濃度為1.0×10~(-5)-1.0×10~(-2)μg·mL~(-1)時,NDM-1/PMB/GCE傳感器的響應(yīng)電流與Pen G濃度呈線性關(guān)系,線性方程為y=326.98x+5.840(r~2=0.9934);當Pen G濃度為1.0×10~(-1)-1.0×10~1μg·mL~(-1)時,響應(yīng)電流與Pen G濃度也呈線性關(guān)系,線性方程為y=0.3304x+9.9346(r~2=0.9927),經(jīng)計算檢測限為0.174 ppb。NDM-1/PMB/GCE傳感器的響應(yīng)電流與AMP濃度也呈線性關(guān)系,當AMP濃度為1.0×10~(-5)-1.0×10~(-2)μg·mL~(-1)時,線性方程為y=322.07x+22.82(r~2=0.9920);AMP濃度為1.0×10~(-2)-1.0×10~1μg·mL~(-1)時,線性方程為y=0.3420x+26.28(r~2=0.9916),檢測限為0.35 ppb。并采用加標法成功實現(xiàn)了牛奶樣品的檢測。研究結(jié)果表明羧基功能化的金屬基介孔碳材料COOH-Co@C和COOH-CoS_2@C可作為載體固定Pen X。所制備的Pen X生物傳感器和NDM-1生物傳感器靈敏度高、檢測限低,能成功實現(xiàn)對牛奶樣品的檢測。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TS252.7;TP212.3
【圖文】：

中起關(guān)鍵作用，NDM-1 不僅可催化多種 β-內(nèi)酰胺的水，MBLs 成員具有一個高度保守的 MBL 折疊，其特征為四層 β 三明治。另一個獨特結(jié)構(gòu)特征是具有一個或兩個活性位點結(jié)合，這是催化反應(yīng)所必需的。NDM-1 的活sn233 疏水殘基組成，是與抗生素底物進行極性相互作用的催化水解抗生素的機制主要是，底物通過 β-內(nèi)酰胺環(huán)1 的側(cè)鏈相互作用而結(jié)合；β-內(nèi)酰胺環(huán)上的羧基與 Zn2 和然后由 Zn1 和 Zn2 穩(wěn)定的氫氧根離子攻擊 β-內(nèi)酰胺環(huán)鍵裂解[78, 79]，在打開 β-內(nèi)酰胺環(huán)時，產(chǎn)生陰離子中間n1 相互作用，來自稠合環(huán)的酰胺氮和羧酸鹽與 Zn2 相中間體質(zhì)子化（如圖 1.2）。

圖 1.2 NDM-1 與 β-內(nèi)酰胺底物結(jié)合（青霉素）的作用示意圖Figure 1.2 Schematic diagram of the action of NDM-1 binding to β-lactam substrate(penicillin)1.4.2 青霉素酶青霉素酶屬于 A 類 β-內(nèi)酰胺酶，是一種絲氨酸水解酶，組成青霉素酶的氨基酸主要有絲氨酸、賴氨酸、色氨酸、組氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等，其水解抗生素的原理是利用活性位點絲氨酸催化 β-內(nèi)酰胺類抗生素（如圖 1.3）[5]。目前常見的青霉素酶是從蠟狀芽孢桿菌中提取純化的，來源于這種 G+的青霉素酶對β-內(nèi)酰胺類抗生素中的青霉素類抗生素有非常強的水解作用，常見的比如青霉素、氨芐青霉素、磺節(jié)西林，而對阿莫西林、吠節(jié)西林僅具有輕微的水解作用。其催化機制主要分為四個步驟：一是底物和酶結(jié)合后，酶的絲氨酸活性位點進攻底物 β-內(nèi)酰胺環(huán)上的羰基，形成四面體�；镏虚g體；二是 β-內(nèi)酰胺環(huán)上的氮原子質(zhì)子化伴隨著 C-N 鍵斷裂，形成酶-抗生素中間體；三是活性水分子進

霉素酶素酶屬于 A 類 β-內(nèi)酰胺酶，是一種絲氨酸水解酶，組成青霉素酶有絲氨酸、賴氨酸、色氨酸、組氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等，其水理是利用活性位點絲氨酸催化 β-內(nèi)酰胺類抗生素（如圖 1.3）[5]。霉素酶是從蠟狀芽孢桿菌中提取純化的，來源于這種 G+的青霉素類抗生素中的青霉素類抗生素有非常強的水解作用，常見的比如青霉素、磺節(jié)西林，而對阿莫西林、吠節(jié)西林僅具有輕微的水解化機制主要分為四個步驟：一是底物和酶結(jié)合后，酶的絲氨酸活性 β-內(nèi)酰胺環(huán)上的羰基，形成四面體�；镏虚g體；二是 β-內(nèi)酰胺質(zhì)子化伴隨著 C-N 鍵斷裂，形成酶-抗生素中間體；三是活性水分重新形成四面體中間體；四是 β-內(nèi)酰胺環(huán)上的羰基與絲氨酸間的共放出有催化水解活性的 β-內(nèi)酰胺酶（如圖 1.4）。

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本文編號：2805582