發(fā)布時(shí)間：2020-08-22 08:19

【摘要】：真菌病害是引起果蔬采后巨大損失的原因之一。利用拮抗酵母抑制果實(shí)采后病害,被認(rèn)為是一種最有希望替代化學(xué)殺菌劑的新型病害防治技術(shù),受到了國(guó)內(nèi)外越來(lái)越多的關(guān)注和研究。通過近30年的研究表明,生防酵母的拮抗機(jī)理主要包括營(yíng)養(yǎng)與空間競(jìng)爭(zhēng)、誘導(dǎo)果實(shí)抗性、分泌水解酶和吸附作用等。在這些機(jī)理中,誘導(dǎo)宿主抗性被認(rèn)為是抑制病原菌的重要因素之一,其與果實(shí)的多種生理代謝活動(dòng)密切相關(guān)。本課題組在前期研究中初步探明了拮抗酵母滅活菌體及其細(xì)胞壁能夠誘導(dǎo)梨果實(shí)對(duì)青霉病的抗性,但拮抗酵母細(xì)胞壁誘導(dǎo)果實(shí)抗性的分子機(jī)理尚不明確。本論文主要以酵母細(xì)胞壁與梨果實(shí)和番茄果實(shí)為研究對(duì)象,探討了酵母細(xì)胞壁誘導(dǎo)果實(shí)抗性依賴的物質(zhì)基礎(chǔ)及其相關(guān)的生物學(xué)機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:(1)酵母細(xì)胞壁誘導(dǎo)梨果實(shí)青霉病抗性的物質(zhì)基礎(chǔ)分析對(duì)比分析了8株拮抗酵母、釀酒酵母、畢赤酵母的活體細(xì)胞、滅活菌體和酵母細(xì)胞壁對(duì)果實(shí)病害的抑制效力,研究表明:除了釀酒酵母和畢赤酵母外,8株拮抗酵母均能夠大幅度的降低梨果實(shí)采后青霉病的發(fā)生;同時(shí),滅活的酵母菌體及酵母細(xì)胞壁均能誘導(dǎo)梨果實(shí)對(duì)青霉病的抗性,其中以海洋紅冬孢酵母(Rhodosporidium paludigenum)的滅活菌體和細(xì)胞壁的效果最佳。對(duì)酵母細(xì)胞壁組分分析表明,不同來(lái)源的同種酵母細(xì)胞壁組成上具有高度相似性,但不同種拮抗酵母的細(xì)胞壁組成上差異較大。進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞壁多糖組分的分析表明,來(lái)源于釀酒酵母和紅冬孢酵母細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)、β-1,3-D-葡聚糖和β-1,6-D-葡聚糖均能誘導(dǎo)梨果實(shí)產(chǎn)生對(duì)青霉病的抗性,而甘露糖蛋白對(duì)梨果實(shí)青霉病的抗性沒有顯著的影響。(2)釀酒酵母細(xì)胞壁幾丁質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定及對(duì)番茄果實(shí)抗性的誘導(dǎo)作用采用烏氏粘度計(jì)、高效液相色譜(HPLC)、傅里葉紅外光譜(FTIR)和核磁共振(NMR)對(duì)釀酒酵母細(xì)胞壁幾丁質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征,并探究了其對(duì)番茄灰霉病的防治效力及相關(guān)機(jī)理。研究結(jié)果表明,酵母細(xì)胞壁幾丁質(zhì)由單糖N-乙酰氨基葡萄糖組成,分子量為4.68×10~5 Dalton,脫乙酰度為45.83%。幾丁質(zhì)不能直接抑制灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的生長(zhǎng),但可以顯著誘導(dǎo)番茄果實(shí)對(duì)由B.cinerea引起的灰霉病的抵抗能力,且誘導(dǎo)效果與處理濃度和誘導(dǎo)時(shí)間密切相關(guān)。進(jìn)一步的分析結(jié)果表明,酵母細(xì)胞壁幾丁質(zhì)誘導(dǎo)了果實(shí)組織中活性氧(ROS)的積累和胼胝質(zhì)的沉積;同時(shí)提高了果實(shí)防御相關(guān)酶(SOD,CAT,POD,PAL,GLU和CHI)活性的增加及其相應(yīng)的基因的上調(diào);而且酵母細(xì)胞壁幾丁質(zhì)處理還激活了水楊酸信號(hào)通路關(guān)鍵基因(ICS,NPR1,TGA1a,TGA2,PR1b1和PR5)的上調(diào)表達(dá)。(3)釀酒酵母細(xì)胞壁β-1,3-D-葡聚糖的結(jié)構(gòu)鑒定及生防效力評(píng)價(jià)通過烏氏粘度計(jì)、HPLC、FTIR和NMR等技術(shù)手段對(duì)β-1,3-D-葡聚糖的分子量(M_w)、單糖組成、特征性官能團(tuán)和碳?xì)湫盘?hào)進(jìn)行了表征。結(jié)果表明,分離得到的β-1,3-D-葡聚糖樣品由單糖葡萄糖組成,分子量為165 kDa,葡萄糖分子間通過β-1,3糖苷鍵連接。在誘導(dǎo)果實(shí)抗性方面,β-1,3-D-葡聚糖不能直接影響擴(kuò)展青霉(Penicillium expansum)孢子在體外和果實(shí)傷口處的萌發(fā),而β-1,3-D-葡聚糖誘導(dǎo)處理顯著抑制了果實(shí)傷口處P.expansum孢子的萌發(fā)。掃描電鏡(SEM)觀察β-1,3-D-葡聚糖處理對(duì)梨果實(shí)傷口組織超微結(jié)構(gòu)影響的結(jié)果表明,β-1,3-D-葡聚糖可以在細(xì)胞組織水平上提高對(duì)P.expansum的抗性。RT-qPCR結(jié)果表明,β-1,3-D-葡聚糖處理顯著提高了果實(shí)傷口周圍組織中PR1、GLU、endoGLU9、CHI3、CHI4、endoCHI、PR4、PR5和PAL基因的上調(diào)表達(dá),進(jìn)而降低了梨果實(shí)青霉病腐爛的發(fā)病率和病斑直徑。(4)酵母細(xì)胞壁葡聚糖合成相關(guān)基因Rho1的遺傳轉(zhuǎn)化及其生防效力評(píng)價(jià)利用特異性引物從釀酒酵母基因組DNA中擴(kuò)增得到目的基因Rho1全長(zhǎng)序列,克隆至載體pYES6/CT后,通過電轉(zhuǎn)化技術(shù)導(dǎo)入至釀酒酵母中,測(cè)序鑒定后成功得到過表達(dá)釀酒酵母菌株SC/Rho1。RT-qPCR結(jié)果顯示,誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h后重組子SC/Rho1中Rho1基因的表達(dá)量較野生型菌株上調(diào)了107.89倍。同時(shí),重組子SC/Rho1細(xì)胞壁中葡聚糖含量增加了9.26%。誘導(dǎo)抗性結(jié)果表明,誘導(dǎo)培養(yǎng)后的酵母細(xì)胞壁顯示出對(duì)梨果實(shí)更強(qiáng)的誘導(dǎo)效果。(5)酵母細(xì)胞壁β-1,3-D-葡聚糖對(duì)誘導(dǎo)梨果實(shí)青霉病抗性的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析對(duì)β-1,3-D-葡聚糖和病原菌處理后的梨果實(shí)組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。結(jié)果表明,經(jīng)釀酒酵母細(xì)胞壁β-1,3-D-葡聚糖與病原菌處理后的梨果肉組織相比于對(duì)照組有5984個(gè)基因上調(diào)表達(dá),8769個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。β-1,3-D-葡聚糖可能通過激活了梨果實(shí)細(xì)胞中模式分子識(shí)別受體FLS2、CNGCs和鈣離子信號(hào)通道,引發(fā)了下游的激素信號(hào)生長(zhǎng)素、茉莉酸、赤霉素和乙烯的傳導(dǎo),導(dǎo)致防御相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MYC2、PTI5、PTI6、WRKY29和WRKY33)的表達(dá),進(jìn)而產(chǎn)生一系列的防御反應(yīng),包括防御相關(guān)基因POD、PAL、HSP90和PR1的變化、氨基酸的生物合成和代謝,以及次級(jí)代謝通路的激活,從而抑制了梨果實(shí)青霉病的發(fā)生和發(fā)展。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S436.612.1;S436.412.1;TS255.3
【圖文】：

圖 1-1 擬南芥葉子中系統(tǒng)獲得性抗性機(jī)制示意圖（Fu & Dong, 2013）Fig. 1-1 Schematic representation of the action mechanism of system acquired resistance inArabidopsis leaves.目前，大量 SAR 化學(xué)誘導(dǎo)劑被報(bào)道，包括水楊酸及衍生物水楊酸甲酯

圖 1-2 植物細(xì)胞內(nèi)水楊酸代謝通路激活示意圖（Kumar, 2014）Fig. 1-2Amodel showing activation of SAsignaling in a plant cell.如圖 1-2 所示，當(dāng)誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)或病原菌攻擊植物時(shí)，脂質(zhì)體通過 ICS/徑開始合成 SA。水楊酸甲基轉(zhuǎn)移酶（SAMT）催化 SA 向 MeSA 的轉(zhuǎn)化

圖 1-3 擬南芥中茉莉酸（JA）信號(hào)通路示意圖（Carvalhais, Schenk, & Dennis, 2017）Fig. 1-3 Schematic representation of the regulation of JAsignal pathway in Arabidopsis.如圖 1-3 所示，當(dāng)植物遭遇外界環(huán)境刺激后，細(xì)胞內(nèi)迅速合成 JA 信號(hào)分子。合成的 JA 與氨基酸 L-Ile 結(jié)合產(chǎn)生具有活性的（3R,7S）-茉莉酮基-L-異亮氨酸

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 田世平,產(chǎn)祝龍;誘導(dǎo)抗性在果蔬采后病害防治中的研究與應(yīng)用(英文)[J];植物病理學(xué)報(bào);2004年05期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 駱瑩;酵母細(xì)胞去除獼猴桃果汁中展青霉素的機(jī)理研究及磁性吸附劑的制備[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 韋朝陽(yáng);蟬擬青霉深層發(fā)酵及其胞內(nèi)多糖的結(jié)構(gòu)研究[D];浙江大學(xué);2015年

本文編號(hào)：2800463