【摘要】：高尿酸血癥目前已成為繼糖尿病的第二大代謝疾病,然而目前臨床上使用的降尿酸藥物容易引起過敏反應(yīng),甚至導(dǎo)致嚴(yán)重的肝腎損傷,因此尋求更安全有效的天然降尿酸產(chǎn)品變得尤為重要。本文選取鰹魚為原料,酶解后經(jīng)分離純化得到純化組分Frc2,對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征和體外黃嘌呤氧化酶(XO)抑制活性分析,研究多肽與XO相互作用的機(jī)制,并構(gòu)建高尿酸血癥細(xì)胞模型評價(jià)其降尿酸活性。采用木瓜蛋白酶水解鰹魚蛋白,制備不同溫度、pH和加酶量的8個(gè)差異樣品,研究其蛋白質(zhì)回收率、體外XO抑制活性、分子量分布和氨基酸含量,并探究不同檢測指標(biāo)之間的相關(guān)性。結(jié)果表明,當(dāng)pH為7.0,溫度為55℃,加酶量為1.00%時(shí),鰹魚蛋白酶解液的蛋白質(zhì)回收率最高,而pH 7.0,溫度55℃,加酶量為0.35%的鰹魚蛋白酶解液的XO抑制活性最強(qiáng)。鰹魚蛋白酶解液中多肽片段主要為分子量小于1000 Da的低聚肽,其分子量分布與XO抑制活性之間無相關(guān)性,而脂肪族氨基酸含量與XO抑制活性基本成負(fù)相關(guān)關(guān)系。以XO抑制活性為指標(biāo)對鰹魚蛋白酶解液進(jìn)行分離純化,采用陰離子交換層析柱和尺寸排阻凝膠過濾色譜柱分離純化得到組分Frc2,在濃度為4 mg/mL時(shí),XO抑制活性達(dá)到32.33%±6.38。結(jié)合高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS/MS)對Frc2進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征,鑒定得到4條多肽序列:Pro-Gly-Ala-Cys-Ser-Asn(PGACSN),Trp-Met-Leu(WML),Ala-Met-Pro-Phe(AMPF)和Phe-Gly-Val-Gly(FGVG)。利用分子對接模擬技術(shù)研究多肽與XO相互作用的機(jī)制,其中多肽AMPF與FGVG均未與XO中關(guān)鍵氨基酸殘基之間存在相互作用,而多肽PGACSN和WML均能嵌入到XO活性疏水腔內(nèi),尤其是多肽WML,幾乎完全嵌入XO疏水腔中,并且二者均能與XO疏水腔中的關(guān)鍵氨基酸殘基之間以氫鍵形式結(jié)合,其結(jié)合能分別為-4.51 kcal/mol和-7.34 kcal/mol。體外合成多肽PGACSN和WML具有很好的XO抑制活性,且20mmoL/L WML的XO抑制活性與20μmoL/L別嘌呤醇溶液相當(dāng)。結(jié)合圓二色譜分析多肽與XO的相互作用,其結(jié)果與分子對接分析結(jié)果一致,多肽明顯改變了XO的二級結(jié)構(gòu),尤其是多肽WML,表明多肽中的氨基酸殘基與XO中的氨基酸殘基之間發(fā)生了相互作用,且疏水性氨基酸可能與XO分子具有更好的親和力。為了探究多肽在生物學(xué)上的降尿酸活性,采用腺苷誘導(dǎo)HK2細(xì)胞構(gòu)建高尿酸血癥細(xì)胞模型,誘導(dǎo)后細(xì)胞上清液中次黃嘌呤含量明顯增加,但是上清液及裂解液中均未檢測到尿酸。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞中XO的表達(dá)量要遠(yuǎn)低于組織中XO的表達(dá)量。通過轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1 XDH提高HK2細(xì)胞中XO的表達(dá)量,采用腺苷誘導(dǎo)后,細(xì)胞上清液及細(xì)胞裂解液中次級代謝產(chǎn)物的變化與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞一致,仍未檢測到尿酸。分析組織和細(xì)胞中尿酸水平和XO活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)10 mg組織中僅能檢測到濃度為0.50μmol/L的尿酸,而未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和轉(zhuǎn)染的細(xì)胞由于XO表達(dá)量不足,檢測不到尿酸的生成,且細(xì)胞中XO的活性低。最后,通過外源性XO結(jié)合腺苷構(gòu)建高尿酸血癥細(xì)胞模型,細(xì)胞上清液中次黃嘌呤完全轉(zhuǎn)化為尿酸,尿酸水平顯著升高。利用XO結(jié)合腺苷構(gòu)建高尿酸血癥細(xì)胞模型評價(jià)多肽PGACSN和WML的降尿酸活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在濃度為2.50 mmol/L時(shí),多肽PGACSN和WML均具有顯著的降尿酸活性。上述結(jié)果表明,鰹魚多肽具有很好的降尿酸功效,進(jìn)一步研究開發(fā)鰹魚多肽,可作為功能性食品或藥品的輔料應(yīng)用于緩解高尿酸血癥及相關(guān)的疾病。
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TS254.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2797792