【摘要】：甜菊糖苷是一類從甜葉菊中提取的非營養(yǎng)性、非發(fā)酵性高倍甜味劑。它具備天然無毒、低熱高甜、性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn),是一種在食品行業(yè)具有廣闊發(fā)展前景的理想甜味劑。溶劑浸提是目前商業(yè)甜菊糖提取的主要工藝,該工藝最后經(jīng)過結(jié)晶回收高純度萊鮑迪苷A(RA)和甜菊苷(ST)之后,剩余母液通常經(jīng)過噴干后成為粉末固體,稱為母液糖(MLS),一般作為低價甜味劑銷售。母液糖中含有60%的甜菊糖苷和一些殘余的多酚、黃酮類雜質(zhì),這些雜質(zhì)的存在不僅加重母液糖后苦味,而且影響糖苷的進(jìn)一步回收。我國每年約產(chǎn)生2000 t母液糖,如果能夠通過除雜使其純度達(dá)到85%以上,價格可以提高2~3倍,本文針對上述問題,目標(biāo)為建立一種操作簡單、可工業(yè)化的從母液糖中回收甜菊糖苷的方法。此外,自甜菊糖苷酶法轉(zhuǎn)化產(chǎn)物被批準(zhǔn)使用后,甜菊糖苷的酶法修飾得到了廣泛關(guān)注,尤其是比RA分別多一個和兩個葡萄糖基的萊鮑迪苷D(RD)和萊鮑迪苷M(RM),它們具有更加優(yōu)良的甜味性質(zhì),因此本文也嘗試采用商業(yè)酶對RA進(jìn)行酶法改性。首先,采用樹脂法對母液糖進(jìn)行純化。優(yōu)選非極性大孔樹脂NDR-1作為吸附基質(zhì),靜態(tài)吸附與解吸的研究結(jié)果表明,在25%(v/v)的乙醇溶液中,在pH 7.00、10~oC的條件下進(jìn)行吸附,在30~oC、100%乙醇不調(diào)節(jié)pH的情況下等體積解吸,糖苷吸附率為92.24%,解吸率86.61%,雜質(zhì)含量由母液糖中的34.13%降低至解吸液中的12.88%�；陟o態(tài)吸附解吸的優(yōu)化乙醇濃度,經(jīng)過NDR-1樹脂的動態(tài)層析(層析柱:1.1×100 cm),母液糖的雜質(zhì)含量降低至4.78%,糖苷回收率為89.88%。進(jìn)一步采用10×100 cm的玻璃層析柱處理300 g(干重)母液糖,雜質(zhì)含量降低至13.79%,糖苷回收率為90.00%,驗(yàn)證了該方法的工業(yè)可行性。其次,采用甲醇重結(jié)晶母液糖結(jié)合樹脂柱層析實(shí)現(xiàn)母液糖除雜。發(fā)現(xiàn)100%(v/v)甲醇對母液糖進(jìn)行重結(jié)晶可以有效除雜,且不同結(jié)晶條件下可以得到不同糖苷組成的晶體,重結(jié)晶工藝優(yōu)化結(jié)果顯示:在料液比1:5,溫度25~oC,攪拌時間24 h的條件下得到的晶體中雜質(zhì)含量最低,為3.11%,結(jié)晶率為42.45%。對剩余母液采用大孔樹脂NDR-1處理,在優(yōu)化條件下(吸附溶劑為35%乙醇,原料樹脂質(zhì)量比1:10)進(jìn)行動態(tài)層析(層析柱規(guī)格:1.1×100 cm),得到純度為98.10%的甜菊糖苷,回收率為95.20%。將重結(jié)晶法和柱層析法聯(lián)合用于母液糖的除雜中試,通過處理300 g(干重)母液糖,最終母液糖中甜菊糖苷的回收率達(dá)到94.18%,所得糖苷中雜質(zhì)含量為2.83%。(經(jīng)過層析處理后雜質(zhì)含量為1.92%)。最后,以RA為受體,篩選轉(zhuǎn)糖基酶和供體底物的結(jié)果表明,轉(zhuǎn)化效率最高的酶和供體底物分別是纖維素酶(Trichoderma reesei)和纖維二糖,經(jīng)條件優(yōu)化(RA 10 g/L,纖維二糖100 g/L,酶濃度為2000 U/mL,溫度70~oC,pH 3.97),得到RA轉(zhuǎn)化率最高為36.05%,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的味質(zhì)得到了一定的改善。以纖維二糖為供體底物,RA經(jīng)纖維素酶轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物分析結(jié)果顯示,其主要的5種轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物為單葡萄糖基-RA的同分異構(gòu)體。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TS202.3
【圖文】：

圖 1-1 甜菊糖苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1-1 Depictions of the chemical structure of steviol glycosides表 1-1 甜菊糖苷主要組分及相應(yīng)性質(zhì)Table 1-1 Main components and characters of steviol glycosides糖苷名稱 R1（C-19） R2（C-13）相對分子質(zhì)量相對甜度參考文獻(xiàn)菊醇（steviol） H- -H 318.5 0 [24]甜菊雙糖苷steviolbioside）H- Glc(β1-2)-Glc(β1 642.7 10~15 [25-28]甜菊苷（ST） Glc(β1- Glc(β1-2)Glc(β1- 804.9 270~300 [25, 26, 29]萊鮑迪苷 A（RA）Glc(β1-Glc(β1-2)[Glc(β1-3)]Glc(β1-967 350 [30, 31]萊鮑迪苷 B（RB）H-Glc(β1-2)[Glc(β1-3)]Glc(β1-804.9 10~15 [28, 32]萊鮑迪苷 C（RC）Glc(β1-Rha(α1-2)[Glc(β1-3)]Glc(β1-951 40~60 [32]萊鮑迪苷 DGlc(β1-2)Glc(β1-Glc(β1-2)[Glc(β1-1129.2 150~250 [33, 34]

晶法結(jié)合層析法回收母液糖中的甜菊糖苷醇重結(jié)晶甜菊糖苷均具有一個疏水的雙萜結(jié)構(gòu)核心，不同的糖苷在 C-13 和 C-19 的糖單元，因此甜菊糖苷是一種雙親性化合物[5,115]。甜菊糖苷在極性不出不同的溶解性質(zhì)，研究表明，在 5oC 下，純水中 RA 的溶解度為 2.0~2.在無水甲醇或無水乙醇中，相同溫度下 RA 的溶解度僅為 0.1~0.2g/100m乙醇中 RA 的溶解度則提高至 3.4~3.6 g/100 mL。這是因?yàn)樵谔囟O性甜菊糖苷通過雙萜結(jié)構(gòu)之間的疏水相互作用，或糖單元上羥基之間的氫從溶劑中沉淀析出[117]。因此通過調(diào)節(jié)醇-水混合溶劑的比例可實(shí)現(xiàn)甜菊[85]，預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，室溫下相同質(zhì)量的母液糖在同等體積的甲醇和乙醇解，1 h 內(nèi)甲醇中即有渾濁產(chǎn)生，隨著攪拌時間的延長直至 40 h，甲醇斷增加，乙醇中始終澄清透明（圖 3-12），可能是由于母液糖是乙醇溶留在母液中的糖苷和雜質(zhì)部分，該部分在乙醇中的溶解性較好，另外，的回收難度遠(yuǎn)大于單一醇溶劑，因此選擇甲醇溶液作為結(jié)晶溶劑。

39 纖維素酶轉(zhuǎn)化 RA 的 UPLC-MS 圖譜（（a）SGs 的總離子流圖；（b）-（g）RA 產(chǎn)物III，IV，V 的質(zhì)譜圖）Fig. 3-24 Negtive ion current chromatogram and the MS spectra of SGs in the mixture ofucosylation to stevioside. (a) Total ion chromatogram of the SGs. (b)-(g) MS spectrum of RIII, IV, V.圖 3-23 中，纖維素酶轉(zhuǎn)化 RA 的產(chǎn)物主要有三個色譜峰對應(yīng)產(chǎn)物 1，2，苷產(chǎn)物總離子流圖（圖 3-24（a））中，保留時間為 2.52min 對應(yīng)的色譜峰為修飾產(chǎn)物有五個峰，依次對應(yīng)產(chǎn)物 I，II，III，IV，V，保留時間分別為 3.1in，3.67 min，3.85 min 和 4.36 min。通過 RA 轉(zhuǎn)苷實(shí)驗(yàn)組和 RA 空白對-MS 結(jié)果對比發(fā)現(xiàn)，RA 不能夠被纖維素酶水解，且在不添加供體底物纖維 RA 不能夠發(fā)生轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)。

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