果汁中櫻桃源性成分識別及定量檢測技術研究

發(fā)布時間：2020-08-18 15:06

【摘要】：隨著人民生活質量的提高,人們對營養(yǎng)價值的追求也越來越高,食品安全質量問題越來越成為人們關注的焦點。櫻桃作為第三代水果品種之一,具有極高的營養(yǎng)價值和功能性成分,具有降低糖尿病、抑制代謝紊亂、抗氧化、抗炎、抗癌等功效。因為櫻桃味道鮮美,口感獨特,價值高昂,為了獲得更多利潤,在櫻桃果汁等產(chǎn)品中摻假、制假成為可能,因此,快速準確的檢測果汁中櫻桃成分可為櫻桃及其制品的產(chǎn)品質量監(jiān)控提供技術支持。(1)櫻桃物種特異性序列的查找。通過NCBI獲得櫻桃、草莓、獼猴桃等19種常見水果共41套基因組。利用Perl語言進行BLAST序列比對,最后挑選出了9對對櫻桃特異性強擴增效果好的引物,其擴增產(chǎn)物測序后確定了櫻桃基因組中特異性區(qū)段的DNA序列。(2)櫻桃物種鑒別特異性PCR方法的建立。以櫻桃、草莓、獼猴桃等19種常見水果基因組DNA為模板,對上述9對引物進行了特異性檢測,PCR體系和退化溫度的優(yōu)化以及靈敏度的測定。結果表明,在9對引物中,che36-F/R引物對擴增效果和特異性最好。在引物濃度為0.4μmol/L、退火溫度為58℃時,PCR鑒別法的靈敏度最好,可達0.5%。實際樣品測試表明此方法可用于混合鮮榨果汁和非鮮榨果汁中櫻桃成分定性鑒別。(3)櫻桃物種鑒別特異性實時熒光PCR方法的建立。根據(jù)櫻桃基因組DNA特異性區(qū)段che36序列設計了兩對引物和探針。qPCR體系和程序優(yōu)化后,che36-1-QF/QR/QP在引物和探針濃度均為0.5μmol/L時,靈敏度可達0.1%。最優(yōu)擴增條件下,制作的標準曲線為y=-3.356x+31.062,R~2=0.998,擴增效率為98.545%,Ct值與櫻桃基因組DNA模板量之間具有y=-1.457ln(x)+29.367的關系,相關系數(shù)R~2為0.9985。通過樣品的測試證明此方法可用于定性鑒別混合鮮榨果汁、非濃縮果汁中櫻桃成分,并能測定櫻桃基因組DNA的含量。(4)櫻桃物種鑒別特異性數(shù)字PCR方法的建立。ddPCR反應體系和程序優(yōu)化后,che36-1-QF/QR/QP在引物濃度為0.5μmol/L、探針濃度為0.2μmol/L、退火溫度為56.7℃時,ddPCR擴增效果最好,線性定量范圍下檢測限為0.24ng櫻桃基因組DNA。特異性區(qū)段che36的拷貝數(shù)和DNA模板量之間具有y=7.4093x+1.2482的線性關系,且相關系數(shù)R~2=1。通過樣品的測試證明此方法可用于定性鑒別混合鮮榨果汁、非濃縮果汁和濃縮果汁中櫻桃成分,并能得到櫻桃特異性片段che36拷貝數(shù)。本研究建立了櫻桃物種特異性鑒定方法,為果汁中櫻桃源性成分的鑒定提供了技術支撐,同時為食品質量安全控制提供了試驗依據(jù)。
【學位授予單位】：河北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TS255.44
【圖文】：

序列,物種特異性,語言分析,百分比

10μmol/L F 1.0 2 40 s/95℃10μmol/L R 1.0 3 30 s/58℃40DNA 模板（25ng/μL） 2.0 4 40 s/72℃ddH2O 8.5 5 10min/72℃ 1總體積 25 6 4℃ ∞2.2 結果與分析2.2.1 生物信息學分析結果通過 Perl 語言分析最終得到了 28800 個櫻桃物種特異性條帶結果。根據(jù)特定百分比（Specific Percent），此值越高說明比對的序列相似性越低。根據(jù)特定百分比從 28800中值篩選出最優(yōu)的 40 條 300~700bp 之間的片段，將這 40 條序列在 NCBI 上 BLAST（如圖 1~17），篩選出特異性較強的 17 對序列。

序列,物種特異性,語言分析,百分比

2.2.1 生物信息學分析結果通過 Perl 語言分析最終得到了 28800 個櫻桃物種特異性條帶結果。根據(jù)特定百分比（Specific Percent），此值越高說明比對的序列相似性越低。根據(jù)特定百分比從 28800中值篩選出最優(yōu)的 40 條 300~700bp 之間的片段，將這 40 條序列在 NCBI 上 BLAST（如圖 1~17），篩選出特異性較強的 17 對序列。圖 1 che01 擴增序列 BLAST 比對結果Figure 1 BLAST result of che01 amplification sequence

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