發(fā)布時間：2020-08-12 11:11

【摘要】：隨著近年來常見水果品種的普及,人們越來越喜愛如桑葚、樹莓、車?yán)遄拥鹊谌�。由于三代水果口感�?營養(yǎng)豐盛,富含具備保健功能的營養(yǎng)因子,所以,無論鮮食還是用于食品或保健品的開發(fā),價格都相當(dāng)昂貴。因此,其產(chǎn)品常會出現(xiàn)以假亂真、以次充好的現(xiàn)象,如某些桑葚加工品中不含桑葚,用廉價水果加香精來達到以假亂真的效果,這不單單欺騙了消費者,也極大地擾亂了市場秩序。運用現(xiàn)代生物信息學(xué)的方法和數(shù)字PCR技術(shù),可建立快速、準(zhǔn)確的定性、定量檢測方法,為保證食品質(zhì)量和維護消費者利益提供監(jiān)察技術(shù)手段。本試驗通過運用生物信息學(xué)的方法,利用perl語言程序下載多種常見水果基因組,并通過BLAST序列比對篩選出桑葚的特異性基因,從篩選的29262條序列經(jīng)分析篩選出目標(biāo)序列進行引物設(shè)計,同時根據(jù)桑葚的這段序列設(shè)計出實時熒光PCR和數(shù)字PCR的引物、探針,通過對引物和探針的特異性、引物濃度和最適反應(yīng)退火溫度進行了篩選和優(yōu)化,建立物種特異性定性、定量檢測方法,并對方法的靈敏度、檢出限和加工品的適用性進行測試。(1)桑葚物種特異性常規(guī)PCR鑒定方法的建立:通過對桑葚物種特異性驗證,PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序條件的優(yōu)化,以及方法靈敏度的確定,試驗結(jié)果表明,本研究建立的方法物種特異性好,最適宜的退火溫度為56℃,引物濃度為0.6μmol/L,在優(yōu)化后的擴增條件下能夠檢測出質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的樣品(DNA,25 ng/μL),且重復(fù)性高。本方法對桑葚純果汁、桑葚?fù)匠戎旌瞎�、桑葚�(fù)教抑吞O果汁混合果汁、桑葚?fù)教抑约袄嬷旌瞎瓨悠贩謩e進行了檢測,樣品中的桑葚成分均能檢出。(2)桑葚物種特異性實時熒光定量PCR鑒定方法的建立:通過桑葚物種qPCR反應(yīng)體系的優(yōu)化,特異性和靈敏度檢測,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液擴增曲線繪制了桑葚物種特異性基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線,完成了對桑葚原性成分定量的檢測。結(jié)果顯示,本法具有特異性強、靈敏度高的特點,定量檢出限0.006 ng/μL的桑葚基因組DNA,桑葚DNA擴增的標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為:y=3.529x+127.18,R2=0.995,擴增效率E%為92.032%,可以用于定量檢測桑葚加工品。本方法可檢測桑葚成分含0.01%的桑葚純果汁以及可鑒定含有桑葚的混合果汁。(3)桑葚物種特異性數(shù)字PCR鑒定方法的建立:在實時熒光PCR試驗篩選的引物和探針基礎(chǔ)上,通過特異性試驗、引物和探針濃度的優(yōu)化、退火溫度的優(yōu)化以及定量線性范圍和LOQ驗證,確定了最佳引物和探針濃度均別為0.4μmol/L,最適宜的退火溫度是57.9℃,定量檢出限可達到0.006 ng/μL的桑葚基因組DNA,根據(jù)數(shù)字PCR曲線方程可計算出樣品濃度,用于桑葚加工品的定量檢測。綜上所述,本研究基于生物信息學(xué)方法,結(jié)合定性PCR、實時熒光PCR、數(shù)字PCR技術(shù)建立了桑葚物種特異性分子生物學(xué)鑒定方法。該方法適用于各種桑葚果汁及加工品的摻偽鑒定,可為食品中桑葚源性成分定性、定量檢測提供了技術(shù)支撐。
【學(xué)位授予單位】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TS255.44;O657.3
【圖文】：

河北農(nóng)業(yè)大學(xué)全日制碩士專業(yè)學(xué)位（畢業(yè)）論文）高等植物內(nèi)源 PCR 擴增結(jié)果以 TRNALue 植物內(nèi)源對 21 種水果 PCR 擴增產(chǎn)物跑膠驗證。結(jié)果（如圖 空白對照沒有擴增出條帶，且引物二聚體少，說明體系良好未受到污染；、車?yán)遄印⑿�、李子、梨、網(wǎng)紋甜瓜、牛油果、榴蓮、西瓜、西柚、柑橘、果、草莓、蔓越莓、桃、火龍果、龍眼、鳳梨和獼猴桃這 21 種水果均擴增帶，條帶大小為 180 bp,說明所提取水果基因組為植物基因組，可用于后續(xù)

表示樣品中存在一些雜質(zhì)，如碳水化合物、鹽（胍鹽）等，表4和表5可看出OD230/OD260的比值基本在 2.0 左右，說明提取 DNA 較為純凈，且其他雜質(zhì)污染較少。由表 9 和表 10 可知，以上桑葚混合果汁的 DNA 濃度都在 25 ng/μL 以上。表 9和表 10 中混合果汁樣品除 S13、S16、S21 這三個樣品外 OD260/OD280的比值基本在1.8~2.0 之間；OD230/OD260的比值基本在 2.0 左右，說明提取 DNA 較為純凈，且其他雜質(zhì)污染較少2.2.2 桑葚定性 PCR 結(jié)果分析2.2.2.1 引物篩選結(jié)果將設(shè)計好的 25 對引物分別與桑葚模板和水果混樣模板進行 PCR，如圖 2，結(jié)果顯示(如圖 2)，桑葚引物 sangshen_02、sangshen_03、sangshen_04、sangshen_05、sangshen_06、sangshen_07、sangshen_08、sangshen_09、sangshen_15、sangshen_23、sangshen_24、sangshen_25 這 12 對引物擴增條帶清晰，且沒有非特異性擴增，因此最終將這 12 對引物的擴增產(chǎn)物進行測序分析。

桑葚及其產(chǎn)品數(shù)字 PCR 鑒定方法的建立及研究sangshen_07、sangshen_08、sangshen_09、sangshen_15、sangshen_23、sangshen_24這 8 對引物與原始序列在 DNAMAN 中進行序列比對。然后篩選出與原始序列差異最小的序列進行后續(xù)試驗驗證。結(jié)果顯示（如圖 3），sangshen_05、sangshen_07、sangshen_08、sangshen_09、sangshen_15、sangshen_23、sangshen_024 這 7 對引物與原始序列比較差異小，基本重合，突變位點少，且測序雙峰穩(wěn)定。sangshen_06 與原始序列比對差異大，且測序峰值混亂，不穩(wěn)定。所以最后選定 sangshen_05、sangshen_07、sangshen_08、sangshen_09、sangshen_15、sangshen_23、sangshen_24 這 7 對引物進行特異性驗證。

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本文編號：2790456