【摘要】：非酒精性脂肪肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是以肝細胞內(nèi)脂肪過度沉積,排除飲酒和其他明確的損肝因素導致的臨床病理綜合征,目前尚無確切和療效顯著的NAFLD治療方法,盡管吡格列酮和維生素E得到國際社會的認可,但也存在一定的副作用。海洋生物活性肽具有功能獨特、結(jié)構(gòu)新穎的特點,利用海洋生物資源開發(fā)出生物活性功能肽是近年來研究的熱門課題。鱈魚(gadus)作為世界上捕獲量最大的魚類之一,其魚肉常用于制作鱈魚片,而鱈魚皮則作為下腳料被丟棄。研究發(fā)現(xiàn)鱈魚皮中含有豐富的膠原蛋白,提取的膠原蛋白活性肽已在很多領(lǐng)域得到了應(yīng)用,但對NAFLD是否有修復(fù)作用目前尚未見報道。本實驗應(yīng)用酶解方法制備鱈魚皮膠原蛋白肽(Cod skin collagen peptide,CSCP),研究其對NAFLD細胞模型和小鼠動物模型的修復(fù)作用,為開發(fā)一種新型的、對NAFLD有修復(fù)效果的護肝類保健品提供實驗依據(jù)。本研究應(yīng)用油酸對Chang liver細胞進行誘導,通過MTT法檢測Chang liver細胞活性,倒置顯微鏡觀察、油紅O染色以及GPO-PAP酶法測定細胞中TG含量為指標建立體外NAFLD細胞模型。以NAFLD細胞中的TG含量為標準對鱈魚皮進行最佳酶種篩選,應(yīng)用單因素和正交實驗確定酶解的最佳工藝,經(jīng)超濾制備高活性的CSCP,探究其體外抗氧化能力。獲得的CSCP作用于NAFLD細胞模型中,測定正常組、模型組、CSCP低劑量組(40μg/mL)和CSCP高劑量組(80μg/mL)培養(yǎng)液中AST、ALT、MDA、SOD、GSH、CAT、ROS含量變化;透射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)來評價CSCP對NAFLD細胞模型的修復(fù)作用。以小鼠為實驗動物,分為正常組、模型組、洛伐他汀陽性對照組(劑量為8 mg/kg/d)、CSCP低劑量組(200 mg/kg/d)和CSCP高劑量組(400 mg/kg/d)。除正常組外,其它各組均在高脂飼料喂養(yǎng)建立的NAFLD小鼠模型上進行灌胃給藥。觀察小鼠的一般行為狀態(tài)與體重變化,實驗結(jié)束取血清與肝臟,計算肝重指數(shù),測定小鼠血清中AST、ALT、HLD、DLD、TG的含量以及肝組織勻漿液中SOD的含量;HE染色和透射電鏡判斷小鼠肝臟的組織結(jié)構(gòu)改變情況。實驗結(jié)果:1.MTT法結(jié)果顯示當油酸濃度為0.25 mmol/L,作用24 h后Chang liver細胞的存活率最高,倒置顯微鏡觀察細胞中的空泡明顯增多;油紅O染色結(jié)果顯示此時細胞中的脂滴出現(xiàn)了明顯融合,且細胞生長形態(tài)較好;細胞中的TG含量明顯升高,表明NAFLD細胞模型成功建立。2.制備CSCP的最佳酶解工藝為:堿性蛋白酶為最優(yōu)酶種,料液比為1:2,pH值為9,加酶量2000 U/g,溫度50℃,時間為10 h;制得的酶解液經(jīng)超濾截留1 KDa的分子段,可使細胞中的TG含量顯著降低,該分子段的多肽即為本實驗所用的CSCP。3.CSCP的體外抗氧化結(jié)果顯示,CSCP對DPPH、羥自由基、ABTS自由基、超氧陰離子自由基具有較好的清除效果,表明CSCP具有很好的抗氧化活性。4.體外細胞實驗結(jié)果顯示,相比于模型組,CSCP加藥組細胞中的AST、ALT、MDA、ROS的含量下降,且呈現(xiàn)劑量相關(guān)性,SOD、GSH、CAT的含量較模型組有所上升。透射電鏡結(jié)果顯示正常組細胞具有較多的微絨毛,而模型組細胞微絨毛數(shù)量減少,有明顯脂滴。加藥組細胞中脂滴含量明顯減少,微絨毛數(shù)量明顯增多,特別是高劑量組的變化更明顯。5.體內(nèi)小鼠動物實驗結(jié)果顯示,CSCP可降低模型組小鼠血清中AST、ALT、DLD和TG的含量,使HLD的含量升高,肝組織勻漿中SOD的含量有下降的趨勢。HE染色結(jié)果顯示,模型組小鼠肝細胞內(nèi)出現(xiàn)較多的空泡脂滴,陽性藥物組和CSCP藥物組得到了較大改善,肝索結(jié)構(gòu)與肝細胞形態(tài)接近于正常。透射電鏡結(jié)果顯示,模型組肝細胞內(nèi)有許多電子密度較低的圓形脂肪滴顆粒,CSCP藥物組和陽性藥物組脂滴明顯減少,線粒體增多,對肝組織修復(fù)作用明顯。實驗結(jié)論:當油酸濃度為0.25 mmol/L,作用Chang liver細胞24 h后可建立NAFLD細胞模型,經(jīng)堿性蛋白酶酶解制備得到的1 kDa分子段的CSCP可以有效降低NAFLD細胞模型中AST、ALT、MDA和ROS的含量,升高細胞中SOD、GSH、CAT的含量,清除有害自由基,顯示了較好的抗氧化活性;同時減輕了高脂飼料誘導建立的小鼠NAFLD模型中肝組織的病變程度,因此CSCP對NFALD具有較好的修復(fù)作用。
【學位授予單位】：浙江海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TS254.9
【圖文】：

注：#與正常組比較，P<0.05圖 2-1 不同濃度的油酸對細胞存活率的影響2-1 effect of different concentration of oleic acid on cell v鏡下細胞形態(tài)結(jié)果 細胞用不同濃度油酸誘導后的倒置顯微鏡形態(tài)的看到，相比于正常組細胞，油酸組細胞隨著濃漸增多，在 0.25 mmol/L 時細胞生長形態(tài)相比較也明顯增多。

注：#與正常組比較，P<0.05圖 2-1 不同濃度的油酸對細胞存活率的影響Fig. 2-1 effect of different concentration of oleic acid on cell viability2.3.2 倒置顯微鏡下細胞形態(tài)結(jié)果Chang liver 細胞用不同濃度油酸誘導后的倒置顯微鏡形態(tài)如圖 2-2 所過圖片可以明顯的看到，相比于正常組細胞，油酸組細胞隨著濃度的增大中的空泡數(shù)量逐漸增多，在 0.25 mmol/L 時細胞生長形態(tài)相比較其他細胞形好，細胞內(nèi)空泡也明顯增多。

鱈魚皮膠原蛋白肽對 NAFLD 的修復(fù)作用2.3.3 油紅 O 染色結(jié)果不同油酸濃度誘導 Chang liver 細胞的油紅 O 染色結(jié)果如圖 2-3 所示，正常組細胞呈上皮樣形態(tài)，周圍有突起，細胞伸展性好，細胞質(zhì)內(nèi)脂滴含量少，隨著油酸濃度的增大，細胞中的紅色顆粒（代表脂滴）數(shù)量明顯增多。在 0.1 mmol/L的油酸濃度下細胞生長狀態(tài)較好，細胞內(nèi)的脂滴變較少；0.2 mmol/L 的油酸濃度下細胞發(fā)生損傷，細胞內(nèi)脂滴含量開始增多，0.25 mmol/L 的油酸濃度下細胞形態(tài)發(fā)生了改變，細胞內(nèi)脂滴增多，脂變明顯，很多脂滴發(fā)生了融合。0.3 mmol/L、0.4 mmol/L 和 0.5 mmol/L 下隨著油酸濃度的升高細胞中脂滴的含量也逐漸增多，且油酸的毒性也隨之增大，細胞核固縮嚴重，細胞數(shù)量減少。根據(jù)結(jié)果最終確定油酸誘導的 NAFLD 細胞模型的最佳濃度為 0.25 mmol/L。

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