【摘要】：絲素蛋白(Silk fibroin,SF)具有良好的物理機(jī)械性能、透氣透濕性、可降解性和生物相容性,在組織工程和生物醫(yī)用材料領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用。本文借助漆酶(Laccase)催化絲素蛋白接枝殼寡糖(COS),制備得到SF-g-COS膜材料;通過(guò)己糖激酶(Hexokinase)催化SF-g-COS膜材料中的COS磷酸化,結(jié)合仿生礦化在磷酸化膜材料表面沉積羥基磷灰石(HAp),制備絲素基仿生礦化材料,拓寬絲素基生物材料的應(yīng)用范疇。研究首先選用絲素中酪氨酸的模型物對(duì)羥基苯乙酰胺(PHAD),考察了漆酶催化PHAD的自聚以及接枝COS的反應(yīng)效果,借助超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜(UPLC-TQD)、核磁共振氫譜(~1H-NMR)、傅立葉變換紅外光譜(FT-IR)分析產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上,通過(guò)體積排阻色譜(SEC)、凝膠電泳(SDS-PAGE)和粒徑分析漆酶催化絲素蛋白溶液接枝COS的交聯(lián)效果,對(duì)比膜材料的抗氧化性、抗菌性、熱性能和生物相容性。研究結(jié)果表明,漆酶可以催化PHAD形成自聚體,并與COS發(fā)生席夫堿和邁克爾加成反應(yīng);SDS-PAGE和SEC結(jié)果驗(yàn)證了絲素蛋白溶液經(jīng)漆酶催化后,SF蛋白分子量增大,絲素蛋白分子間發(fā)生自交聯(lián)和接枝COS反應(yīng),制備得到的SF-g-COS膜材料具有較好的抗氧化性和抗菌性。在SF-g-COS膜材料制備基礎(chǔ)上,借助己糖激酶和三磷酸腺苷(ATP)催化COS磷酸化。采用高效液相色譜(HPLC)、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)和磷含量測(cè)試,探究酶促COS磷酸化的反應(yīng)機(jī)制和作用效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn),己糖激酶可以催化COS中C6位的羥基磷酸化,并伴隨著二磷酸腺苷(ADP)的生成;經(jīng)己糖激酶磷酸化的COS的FT-IR結(jié)果中出現(xiàn)P=O和C-O-P的伸縮振動(dòng);SF-g-COS膜材料經(jīng)過(guò)磷酸化處理后,磷含量明顯增加。將磷酸化SF-g-COS膜材料在Ca/P溶液中進(jìn)行交替法仿生礦化,借助X射線(xiàn)衍射(XRD)、掃描電子顯微鏡(SEM)和表面能譜圖像(EDS-Mapping),分析了表面礦物相HAp的沉積效果,結(jié)果表明磷酸化處理改善了絲素膜材料的礦化效果,磷酸化的SF-g-COS膜表面形成更多HAp結(jié)晶相。此外,MG-63成骨細(xì)胞在上述絲素基仿生礦化材料表面具有較好的增殖和黏附效果,材料具有良好的生物相容性,在組織工程材料領(lǐng)域有潛在應(yīng)用前景。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：TS102.33
【圖文】：

圖 1-1 漆酶催化酚類(lèi)接枝氨基化合物的反應(yīng)機(jī)理Fig.1-1 The Schematic illustration of the laccase-assisted grafting of amide on phenol1.3.2 己糖激酶的催化機(jī)理己糖激酶（Hexokinase）的催化機(jī)理是在 ATP 和 Mg2+的參與下，能夠?qū)⑷姿嵯佘眨ˋTP）中的末位磷酸根轉(zhuǎn)移到六元糖的 6 位羥基上，同時(shí)伴隨著二磷酸腺苷（ADP）和 6-磷酸六元糖的生成[46]，其反應(yīng)機(jī)理如圖 1-2 所示。

1.2.3 可以看出，在仿生礦化過(guò)程中，增加有機(jī)質(zhì)表面陰離子基團(tuán)的數(shù)目更加有利于 Ca2+的配位，從而生成更多的羥基磷灰石。1.5 本課題研究的目的、意義和內(nèi)容1.5.1 研究的目的和意義絲素蛋白作為一種可生物降解的天然高分子，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)材料、生物傳感器和日化產(chǎn)品加工等領(lǐng)域。采用生物酶法對(duì)絲素蛋白進(jìn)行改性，不僅是一種安全環(huán)保的方法，而且能賦予絲素蛋白材料新的應(yīng)用性能，具有很廣泛的應(yīng)用前景。為此，如圖 1-3 所示，本課題借助漆酶催化 SF 蛋白與 COS 發(fā)生席夫堿和邁克爾加成反應(yīng)，制備得到 SF-g-COS 復(fù)合材料；在此基礎(chǔ)上，通過(guò)己糖激酶催化 COS 的 C6 位羥基磷酸化，在絲素蛋白的表面引入陰離子磷酸根基團(tuán)，提高對(duì)仿生礦化液中鈣離子的結(jié)合能力，即在后續(xù)交替仿生礦化，更能有效地誘導(dǎo)磷酸化 SF-g-COS 復(fù)合材料吸附鈣離子，通過(guò)鍵合和有序沉積將更多規(guī)整的羥基磷灰石晶體沉積在材料的表面上。通過(guò)上述研究，旨在以生物酶法替代傳統(tǒng)化學(xué)法，建立一種絲素基仿生礦化材料制備方法，拓展絲素蛋白在骨組織工程方面的應(yīng)用。

圖 2-1 不同濃度 COS 的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.2-1 The standard curve of different concentration of COSSC 分析和熱重法-微商熱重法（TG-DTG）用 DSC Q200 差示掃描量熱儀以 10°C /min 的升溫速度在 0-300°C 范圍內(nèi)F 膜進(jìn)行 DSC 分析。其中，樣品質(zhì)量約 5.0 mg，氮?dú)饬魉?50.0 mL/min。用 TAQ500 熱重分析儀將礦化前后的 SF 膜進(jìn)行 TG/DTG 分析，在石英坩質(zhì)量約為 5.0 mg，測(cè)試的升溫范圍為 30-650°C，升溫速度為 10°C/min，mL/min。 抗氧化性能測(cè)試過(guò) ABTS 法可評(píng)價(jià)通過(guò)不同處理后 SF 膜的抗氧化性能，其原理在于 AB作用下生成自由基 ABTS·+，如果樣品能夠使藍(lán)色的 ABTS·+還原成無(wú)色，有降低過(guò)氧自由基的的作用。通過(guò)測(cè)定反應(yīng)前后吸光度的變化，可定量表氧化性的大小[29]。BTS·+陽(yáng)離子自由基的制備是將 7 mM 的 ABTS 和 2.45 mM 的過(guò)硫酸鉀等

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本文編號(hào)：2776352