【摘要】：當(dāng)今的食品安全問題已經(jīng)成為危害全世界公共衛(wèi)生的重要組成部分,而食源性致病菌則是食品安全領(lǐng)域不容忽視的一個方面。目前針對食源性致病菌的常見檢測方法包括傳統(tǒng)檢測方法,如病原微生物分離培養(yǎng)鑒定,免疫學(xué)檢測方法,如酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme linked immunosorbent assay;ELISA),核酸類檢測方法,如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(Polymerase Chain Reaction,PCR)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)等等。這些方法大多存在檢測時間較長、操作步驟較為繁瑣、需要人為主觀因素判斷等局限性。本研究以鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella Typhimurium)、布魯氏桿菌(Brucella spp.)、蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)和志賀氏菌(Shigella spp.)四種食品衛(wèi)生和安全領(lǐng)域常見的食源性致病菌為檢測對象,使用Luminex液相芯片(High-throughput Suspension Array)xTAG(Flexible Sequence-tagged,xTAG)技術(shù),建立了四種食源性致病菌的快速檢測方法。并進(jìn)行了方法學(xué)評價實驗及模擬樣本檢測。研究目的:建立鼠傷寒沙門氏菌、布魯氏桿菌、蠟樣芽胞桿菌、志賀氏菌四種食源性致病菌的液相芯片xTAG技術(shù)的快速檢測方法,并對檢測方法進(jìn)行完整的方法學(xué)評價和模擬樣本檢測試驗。研究方法:根據(jù)四種食源性致病菌的保守基因分別設(shè)計引物,在上游引物的5'端連接特定的TAG探針序列(與微球所修飾的anti-TAG探針序列反向互補(bǔ))并使用C3間隔臂進(jìn)行阻隔,下游引物5’端用生物素(Biotin)標(biāo)記。分別提取四種致病菌基因組DNA后進(jìn)行多重PCR試驗并優(yōu)化反應(yīng)條件。將多重PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物與微球雜交,再與鏈霉親和素藻紅蛋白(Streptavidin,R-Phycoerythrin Conjugate,SPAE)進(jìn)行孵育結(jié)合后利用Luminex200液相芯片系統(tǒng)檢測得到熒光中度值(MFI),并對該方法進(jìn)行方法學(xué)評價試驗(特異性、靈敏性、穩(wěn)定性)。最后使用脫脂牛奶隨機(jī)混合四種致病菌完成模擬樣本檢測試驗,實現(xiàn)對檢測方法特異性的再次驗證。研究結(jié)果:成功建立液相芯片xTAG技術(shù)對鼠傷寒沙門氏菌、布魯氏桿菌、蠟樣芽胞桿菌、志賀氏菌這四種食源性致病菌的快速檢測方法,多重PCR反應(yīng)最適退火溫度為52℃,微球雜交條件為:36℃,35min。SPAE孵育條件為38℃,40min。方法學(xué)評價實驗結(jié)果顯示,該檢測方法特異性達(dá)到100%,四種致病菌菌液檢測靈敏度均可達(dá)到1CFU/mL,同批次內(nèi)五組重復(fù)實驗之間變異系數(shù)(CV)均小于5%,不同批次的12組脫脂牛奶模擬模擬實際樣本檢測試驗結(jié)果準(zhǔn)確性為100%。所有陽性判定結(jié)果MFI值均≥5倍陰性對照組。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TS207.4
【圖文】：

.5 液相芯片技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用液相芯片（Liquid chip）又稱為多功能懸浮陣列（multi-analyte suspension array,M是高通量懸浮陣列（High-throughput Suspension Array）等，是20世界90年代中期由minex公司研究發(fā)開研制的一款新型高通量液相分析平臺。液相芯片技術(shù)是融合了光點(diǎn)陣技術(shù)、免疫分析技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)、熒光編碼微球技術(shù)、最新的高速數(shù)字理技術(shù)及高通量分析于一體的新型生物分子檢測技術(shù)[72-73]。1997年，Clinical Che志把液相芯片技術(shù)稱為真正應(yīng)用與臨床的生物芯片，這項技術(shù)在2010年得到了美國品管理局（Food and DrugAdministration，F(xiàn)DA）的許可認(rèn)證，成為第一個應(yīng)用在多指標(biāo)檢測技術(shù)。Luminex不斷進(jìn)行技術(shù)革新和開發(fā)，在十多年期間先后推出了minex100、Luminex200（圖1.1）和Flexmap3D。在步入后基因組時代，基于液相芯研發(fā)出高通量的分析檢測應(yīng)用平臺，為生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供了強(qiáng)大的支持。

以熒光報告分子，這樣就是上機(jī)檢測。檢測時，當(dāng)單個微球通過檢測通道時，儀器兩種激光進(jìn)行檢測，621nm 處的紅色激光可以激發(fā)微球表面的紅色分類熒光，從而球的種類，511nm 出的綠色激光可以激發(fā)報告分子表面的綠色熒光，進(jìn)而確定成功分子結(jié)合的微球數(shù)量等等信息，通過雙色激光達(dá)到定性和定量的分析[75]。為了控制列與微球雜交的嚴(yán)格雜交條件，保持高度的特異性，增強(qiáng)信噪比，使結(jié)果更直觀，片系統(tǒng)選擇使用四甲基氯化銨緩沖液為（Tetramethyl ammonium chloride，TMAC）

綜合征患者血液里與細(xì)胞活性相關(guān)的各類細(xì)胞因子，為確定這種疾病的診斷標(biāo)志物進(jìn)行了研究 。圖1.3 液相芯片檢測系統(tǒng)工作原理Fig 1.3 The working principle of the liquid chip detection system

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3 史

本文編號：2775989