【摘要】：乳及乳制品摻假鑒別是食品安全質(zhì)量控制面臨的重要挑戰(zhàn)。近年來PCR尤其是多重PCR為乳制品動物源性的快速鑒定提供了重要方法,但是大多利用電泳、多色熒光標(biāo)記或者測序?qū)崿F(xiàn)多重檢測,操作繁瑣成本較高。本研究主要利用HRM技術(shù)建立多重PCR檢測方法,對乳及乳制品市場上常見的山羊、綿羊、牛和水牛四種動物源性成分,實現(xiàn)準(zhǔn)確、快速、低成本的鑒別檢測。具體研究和結(jié)果如下:(1)水牛乳中牛乳成分鑒別的雙重PCR-HRM檢測方法研究。通過比對牛和水牛的線粒體基因組序列,分別設(shè)計了牛和水牛的物種特異性引物。實驗結(jié)果顯示,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值分別為77℃和81℃,在傳統(tǒng)熔解曲線中存在交叉重疊,同時檢測牛和水牛線粒體DNA時會有干擾存在;而在HRM分析中,牛和水牛的擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解峰則完全分離,表明HRM相對于傳統(tǒng)熔解曲線,更容易實現(xiàn)對Tm差異較小擴(kuò)增產(chǎn)物的準(zhǔn)確有效區(qū)分。進(jìn)一步優(yōu)化了雙重PCR-HRM反應(yīng)體系,實現(xiàn)了對水牛乳摻偽的牛乳成分的有效鑒定,對水牛乳中摻假的牛乳成分最低檢出限為1%,并且通過對熔解峰高和摻假比例的對數(shù)值進(jìn)行線性擬合,能夠?qū)崿F(xiàn)對摻假比例的相對定量。(2)基于特異性引物的乳制品中山羊、綿羊、牛和水牛乳成分的多重PCR-HRM檢測方法研究。為了進(jìn)一步提高檢測通量,在前面工作的基礎(chǔ)上,通過引物的篩選和調(diào)節(jié),建立了一種可以同時檢測四種乳品動物源性成分的方法。結(jié)果顯示,四重PCR-HRM體系中山羊、綿羊、牛和水牛擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度分別為86.7℃、77.7℃、83.7℃和80.2℃,熔解峰之間沒有重疊。特異性、靈敏度以及不同組合樣品的實驗結(jié)果表明,該方法具有良好的特異性和靈敏度,各物種之間沒有相互干擾。該方法對綿羊線粒體DNA模板的檢出限為2pg,對山羊、牛和水牛線粒體DNA檢出限則為0.2pg,并可實現(xiàn)乳及乳制品市售樣品中牛羊源性成分的快速準(zhǔn)確鑒別檢測。(3)山羊乳中牛乳成分鑒別的雙重PCR-HRM方法研究。在上述工作中,PCR-HRM能夠有效區(qū)分Tm差異較小的擴(kuò)增產(chǎn)物,但是Tm差異仍需2℃。在本章工作中,利用HRM技術(shù)能夠提供的更豐富的熔解曲線信息,實現(xiàn)了對Tm差異1℃的山羊和牛PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的同時檢測。結(jié)果顯示,山羊和牛的擴(kuò)增產(chǎn)物Tm分別為80℃和80.3℃,HRM熔解峰相互重疊難以同時鑒別牛羊源性組分,但是通過HRM熔解曲線形狀分析可以實現(xiàn)羊乳和牛乳成分的同時鑒別。此外,該方法還可以定量檢測混合樣品的摻假比例,牛乳對羊乳的摻假檢出限到達(dá)0.1%。因此,PCR-HRM能夠?qū)m差異1℃的多重擴(kuò)增產(chǎn)物實現(xiàn)準(zhǔn)確的鑒別檢測。(4)基于通用引物的乳制品中山羊、綿羊、牛和水牛源性成分的PCR-HRM檢測方法研究。以上多重PCR反應(yīng)中,需要使用多對特異性引物實現(xiàn)對多個物種的同時鑒別,多對引物的存在容易引起非特異性擴(kuò)增,并且引物間擴(kuò)增效率不一致、需要多次反復(fù)優(yōu)化。為了克服這種局限,通過設(shè)計一對通用引物,實現(xiàn)了在同一PCR反應(yīng)中能夠同時擴(kuò)增山羊、綿羊、牛和水牛的目的基因。結(jié)果顯示,該引物對的通用性和特異性良好,且各擴(kuò)增序列都會產(chǎn)生具有自己獨特特征的HRM熔解曲線,根據(jù)這種差異能夠?qū)崿F(xiàn)這4種乳源性成分的快速鑒別。此外,該方法能夠?qū)λ?5種可能的組合,實現(xiàn)準(zhǔn)確有效的區(qū)分,并能夠定量牛乳與水牛乳以及牛乳與山羊乳的摻假比例。因此,PCR-HRM技術(shù)可以實現(xiàn)乳及乳制品中牛羊源性成分的低成本快速鑒別。
【學(xué)位授予單位】：陜西科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TS252.7
【圖文】：

圖 1-2 高分辨熔解技術(shù)中的染料對比Fig. 1-2 HRM saturating and non-saturating dyes（1）影響 HRM 分析的 PCR 試劑與擴(kuò)增條件、熒光染料及儀器軟件與普通 PCR 反應(yīng)一樣，選擇可靠的 PCR 反應(yīng)試劑以及合適的擴(kuò)增反應(yīng)條件，以確獲得高純度的 PCR 特異性產(chǎn)物對于 HRM 分析的成功也至關(guān)重要。PCR 反應(yīng)試劑如NA 聚合酶、PCR 緩沖液，擴(kuò)增條件包括退火溫度、循環(huán)次數(shù)等條件均直接影響 PCR物的質(zhì)量，其中引物二聚體和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的生成將降低樣品的擴(kuò)增效率，影響CR 產(chǎn)物的熔解和 HRM 分析的準(zhǔn)確性。此外，緩沖溶液的離子強(qiáng)度及添加劑也影響著CR 結(jié)束后的熔解步驟和 HRM 分析的分辨率。因此，PCR 試劑與擴(kuò)增條件都需要仔細(xì)化，必要時需在進(jìn)行 HRM 分析之前，使用經(jīng)典的熔解曲線分析或者凝膠電泳對 PCR物的特異性進(jìn)行檢驗，以確認(rèn) HRM 熔解曲線中的差異源于模板 DNA 中的序列變異。飽和熒光染料是經(jīng)典熔解曲線分析和 HRM 分析之間最大的區(qū)別。SYBR Green I 染用于經(jīng)典熔解曲線分析，但由于其對 PCR 的抑制作用較強(qiáng)，屬于非飽和染料，加之染本身在 DNA 雙鏈熔解的過程中容易發(fā)生重排，導(dǎo)致熔解結(jié)果失真并影響檢測的分辨

乳制品中牛羊源性成分的 PCR 高分辨熔解檢測方法與驗證整性鑒定提取出高質(zhì)量的 DNA 是運用 PCR 技術(shù)進(jìn)選擇的方法合適，其可以最大限度地提高在。依據(jù)實驗室已有的工作基礎(chǔ)，這里選用A[38]。對提取的 DNA 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，明磁珠法提取的 DNA 完整性良好，沒有到理想的擴(kuò)增區(qū)域，相對于山羊、奶牛和可能是由于綿羊 DNA 的質(zhì)量濃度較小，需

牛乳中摻假奶牛乳的雙重 PCR 研究，主要是根據(jù)作繁瑣、耗時，探針法針對不同的靶標(biāo)設(shè)計特異雙重 PCR-HRM 克服了以上的不足，實現(xiàn)了快速通過設(shè)計的特異性引物對奶牛和水牛 DNA 進(jìn)行牛和水牛在 35 個循環(huán)內(nèi)可以產(chǎn)生明顯的擴(kuò)增曲的片段大小分別 161bp 和 175bp，通過瓊脂糖凝2-2 插圖），在水牛和奶牛模板等比例混合樣品中的擴(kuò)增片段長度相差較小（14bp），采用瓊脂糖凝。傳統(tǒng)的熔解曲線水牛和奶牛的熔解溫度分別為重疊部分（圖 2-3A），根據(jù)曾少靈等[59]的研究，雙重 PCR 反應(yīng)時，混合模板的熔解曲線會積累顯此，為了同時鑒別奶牛和水牛乳源性成分，采用鑒別，結(jié)果顯示（圖 2-3B）水牛和奶牛特異性引熔解曲線可以有效區(qū)分水牛和奶牛成分，這就水牛乳中摻假的奶牛乳成分提供了理論依據(jù)。

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