【摘要】：乳鐵蛋白(Lactoferrin,LF)與骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)是乳中重要的蛋白質(zhì),具有多種生物活性功能。LF與OPN具有高親和性,可通過靜電力互作發(fā)生凝聚生成復(fù)合物,其復(fù)合物的潛在功能仍未明了。母乳是嬰幼兒所需的最佳營養(yǎng)來源,是指導(dǎo)配方奶粉設(shè)計參考的黃金標(biāo)準(zhǔn)。為了探索牛乳LF與OPN形成的復(fù)合物是否具有生物活性功能進(jìn)而為嬰幼兒提供可靠的營養(yǎng)來源,本研究首先在體外探究了母乳LF與OPN的互作特性以及LF-OPN復(fù)合物的消化特性來評估復(fù)合物是否可以抵御消化從而被完整吸收,并在腸道生長發(fā)育、抑菌作用、免疫調(diào)控等生物活性功能上進(jìn)行了研究,為后續(xù)牛乳蛋白研究提供理論依據(jù);隨后系統(tǒng)地研究了牛乳LF與OPN的互作與消化特性,并且在生物活性方面聚焦了腸道生長發(fā)育功能在體外探索了牛乳LF-OPN復(fù)合物的功效及其作用機(jī)制;最后,設(shè)計了不同比例牛乳LF與OPN添加到配方奶粉,檢測了配方粉在促進(jìn)細(xì)胞增殖分化、抗菌免疫方面的生物活性功能,初步探究了 LF-OPN復(fù)合物用于配方奶粉中的可行性。1母乳LF-OPN復(fù)合物生物活性評估利用母乳提取的LF與OPN制備成LF-OPN復(fù)合物,在細(xì)胞增殖、分化、抑菌免疫等方面進(jìn)行了評估。母乳LF與OPN在pH 3.8時聚合最為明顯,并且復(fù)合物比單體更能抵御體外消化。同時,母乳復(fù)合物相較于單體顯著促進(jìn)人小腸腺窩狀細(xì)胞(HIEC)增殖;對于Caco-2-細(xì)胞的分化具有顯著促進(jìn)作用;復(fù)合物與單體均具有抑菌作用(P0.05),可抑制大腸桿菌生長以及粘附Caco-2細(xì)胞的作用,其作用效果為LFLF-OPN復(fù)合物OPN,復(fù)合物的抑菌作用效果與LF更為貼近。復(fù)合物與單體均對Caco-2細(xì)胞分泌免疫因子IL-18起顯著促進(jìn)作用(P0.05),且作用效果介于兩單體之間。2牛乳LF、OPN的互作與復(fù)合物消化特性研究研究了不同因素對牛乳LF與OPN互作的影響。首先檢測pH、蛋白比例、濃度、離子作用力、溫度等因素對兩蛋白互作的影響。發(fā)現(xiàn)在pH3.8時,牛源LF與OPN發(fā)生互作最為顯著,觀察到凝聚現(xiàn)象生成膠體;LF與OPN的比例為3:1時,溶液渾濁度最大,互作最顯著;蛋白濃度越高、離子作用力越小時,兩蛋白發(fā)生凝聚現(xiàn)象越明顯;復(fù)合物在4℃、37℃和60℃下呈現(xiàn)不同的狀態(tài),在37℃(體溫)下呈現(xiàn)膠體狀。3牛乳LF-OPN復(fù)合物對小腸上皮細(xì)胞增殖的影響及作用機(jī)制與母乳復(fù)合物相一致,牛乳LF-OPN復(fù)合物同樣具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的效果,并且當(dāng)牛乳蛋白與母乳蛋白形態(tài)最為相近時,即LF為鐵離子游離態(tài)、OPN為鈣離子飽和態(tài),效果最為顯著。研究促進(jìn)增殖機(jī)制發(fā)現(xiàn),LF-OPN復(fù)合物與細(xì)胞上的LF受體和OPN受體共定位,說明復(fù)合物可能與小腸上皮細(xì)胞受體相結(jié)合并進(jìn)而激活相關(guān)信號通路進(jìn)行調(diào)控。此外,免疫共沉淀結(jié)果顯示復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)仍以復(fù)合狀態(tài)存在。進(jìn)一步的信號通路驗證發(fā)現(xiàn),相較兩單體,復(fù)合物顯著促進(jìn)PI3K/Akt信號通路激活;添加化學(xué)小分子抑制劑抑制信號通路的激活則顯著抑制由復(fù)合物誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖,證明復(fù)合物通過PI3K/Akt信號通路調(diào)控促進(jìn)細(xì)胞增殖。4不同配比LF與OPN復(fù)合物應(yīng)用于嬰兒配方奶粉的評估鑒于牛LF-OPN復(fù)合物具有抵御消化以及相關(guān)生物活性功能,設(shè)計添加三種不同比例的LF與OPN,體外初步評估了在嬰兒配方奶粉中的效果。首先體外模擬消化評估發(fā)現(xiàn),當(dāng)LF與OPN比例為3:1時,抵御胃腸道的消化效果最佳;在生物活性功能方面發(fā)現(xiàn)當(dāng)LF與OPN比例同樣為3:1時,在促進(jìn)細(xì)胞增殖分化、抑菌作用和促進(jìn)免疫因子IL-18的分泌效果最為顯著(P0.05),提示了 LF與OPN復(fù)合物用于嬰兒配方奶粉的適宜比例。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)乳LF-OPN復(fù)合物具有促進(jìn)生長發(fā)育、抑菌免疫等作用效果,探究了其理化方面的互作特性進(jìn)而得到優(yōu)化乳LF-OPN復(fù)合物的條件,揭示了復(fù)合物的生物活性功能及其作用機(jī)制。本研究結(jié)果為LF與OPN應(yīng)用于改善嬰兒配方奶粉提供了理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TS252.1
【圖文】：

２０１７）。其中乳活性蛋白的生物活性功能涉及到諸多方面，如促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的逡逑吸收、促進(jìn)酶活反應(yīng)、調(diào)控腸道微生物、促進(jìn)細(xì)胞增殖、調(diào)控免疫系統(tǒng)、抵抗病逡逑原微生物等（Ｌ６ｎｎｅｒｄａｌ，２０１６）。乳中的活性蛋白被攝取進(jìn)入機(jī)體（圖１－１），經(jīng)過逡逑嬰幼兒胃腸道的消化釋放出活性肽以及氨基酸作為營養(yǎng)來源，作用效果主要集中逡逑在腸道的消化以及發(fā)育過程中，但同時對整個機(jī)體水平也有著調(diào)控影響作用，例逡逑如免疫系統(tǒng)發(fā)育、大腦神經(jīng)發(fā)育等方面，既有短期的效果，從長遠(yuǎn)看也對機(jī)體日逡逑后的生活有著深遠(yuǎn)的影響。乳活性蛋白的生物活性功能很多來自隱藏于蛋白質(zhì)中逡逑的小肽。經(jīng)過胃腸道的消化，乳活性蛋白被水解釋放出小肽。已有諸多報道利用逡逑不同的體外模型模擬嬰幼兒的消化環(huán)境以及小肽表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，人乳蛋白尤其是逡逑１３－酪蛋白產(chǎn)生了多種多肽（Ｙａｓｕａｋｉ和Ｂｏ，２０１５；Ｄｅｇｌａｉｒｅ等，２０１６），而人乳中的逡逑內(nèi)源肽濃度在１０－２０邋ｍｇ／Ｌ之間，僅相當(dāng)于總?cè)榈鞍椎模埃保ュ澹ǎ模幔欤欤幔蟮�，２０１５）。逡逑蛋白質(zhì)是幼體必須營養(yǎng)素之一

邐浙江大學(xué)博士學(xué)位論文邐逡逑Ｂｏｖｉｎｅ邋ＬＰＶＫＰＴ＾Ｇ＾ＥＩ＾ＱＩＪＷＫＹＰＤＡＶＡｒＳｆＬＫＰＤＰＳＱＫＱＴＦＬＡＰ0Ｎｇｖｇａ￡ＥＴＤＤＮＫＱＮＴＬＩ＞ｇＫａＪＥ§ＰＥＱＴＤＤＬＤＤＤＤＤＮ邐邐７８逡逑Ｈｕｍａｎ邋ＩＰＶＫＡＳＧ￡ＫＹＫＫＹＰＤＡＶＡＴＷＬＮＰＤＰＳＱＫ0ＮＬＬＡＰＡＶ：ＥＫＰＦＫＴＬｐＫＥＨＤＨＭＤＤＭＤＤＥＤＤＤＤＨＶＤ邋８２逡逑

圖１－３邋０１４對蛋白質(zhì)聚合的物理狀態(tài)影響（１＾0８（：１＾丨５等，２0１７）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－３邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｐＨ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｆｏｒｍａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｃｏｍｐｌｅｘ逡逑３乳蛋白互作的研究逡逑３．邋１概述逡逑食品工業(yè)中常見的靜電力復(fù)合物主要由帶正電的球蛋白和帶負(fù)電的多生，最初由Ｔｉｅｂａｃｋｘ報道（Ｔｉｃｂａｃｋｘ，邋１９１１）阿拉伯膠和明膠的聚合，從后續(xù)一系列研究。復(fù)合凝聚物是具有許多潛在功能特性的自組裝結(jié)構(gòu)，可用裝生物活性化合物，以保護(hù)這些敏感成分在儲存和制造期間以及在胃腸道間免受化學(xué)和物理降解，進(jìn)而有效地保證其生物功效。帶有相反電荷蛋白質(zhì)的互作以及自組裝是近些年興起的研究話題。逡逑乳蛋白是生物聚合物，具有化學(xué)和結(jié)構(gòu)上的靈活性，可用作疏水分子或的載體，它們是用于形成和穩(wěn)定含有疏水性生物活性物質(zhì)乳液的表面活性

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