【摘要】：加工番茄是新疆的支柱性產(chǎn)業(yè)之一,種植面廣,產(chǎn)量高,是新疆經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要助力部分。番茄屬于呼吸躍變型果實(shí),在成熟過程中乙烯產(chǎn)量驟增、果實(shí)快速軟化。因此,探索能夠抑制番茄果實(shí)過度軟化、延長貨架期、便于儲存運(yùn)輸、增加銷售品質(zhì)的方法顯得尤為重要。游離N-聚糖廣泛存在于植物細(xì)胞的各個(gè)細(xì)胞器中,參與果實(shí)的成熟軟化。糖苷水解酶α-甘露糖苷酶(a-Man)和β-DN-乙酰氨基己糖苷酶(β-Hex)屬于不同的糖基水解酶家族,二者都是N-聚糖加工過程中的關(guān)鍵酶,并且在果實(shí)成熟期間特異性表達(dá),可以促進(jìn)游離N-聚糖的產(chǎn)生,加速番茄果實(shí)成熟軟化。目的:在加工番茄中建立CRISPR/Cas9基因編輯體系,靶向編輯加工番茄內(nèi)源基因a-Man和β-Hex,獲得a-Man和β-Hex基因失活、功能喪失的突變體番茄植株。從而抑制N-糖蛋白降解、減弱番茄成熟期果實(shí)的軟化程度,為延長番茄采后保質(zhì)期提供技術(shù)支持。方法:實(shí)驗(yàn)根據(jù)α-Man和β-Hex基因序列全長,篩選合適的編輯靶點(diǎn),確定靶序列,并在α-Man和β-Hex基因的第一個(gè)外顯子上設(shè)計(jì)單個(gè)guide RNA(gRNA),由番茄U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá),以及串聯(lián)的兩個(gè)sgRNA,由RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá),分別構(gòu)建單靶點(diǎn)和雙靶點(diǎn)植物表達(dá)載體,指導(dǎo)由35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)的Cas9核酸酶作用于目的基因;首先以野生型加工番茄成株為實(shí)驗(yàn)材料,通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)化驗(yàn)證雙靶點(diǎn)編輯載體的有效性;其次以番茄子葉、葉柄和莖段作為外植體,對加工番茄進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化;通過限制性內(nèi)切酶酶切結(jié)合PCR擴(kuò)增的方法檢測基因編輯情況,并經(jīng)過單克隆測序確定α-Man或β-Hex基因突變體。結(jié)果:構(gòu)建了基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的植物表達(dá)載體pKAN-sgR-Cas9-Man和pKAN-sgR-Cas9-Hex,以及用于雙靶點(diǎn)編輯的載體pDIRECT-Man和pDIRECT-Hex;經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化獲得14個(gè)α-Man基因獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件,6個(gè)β-Hex基因獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件;對轉(zhuǎn)基因加工番茄α-Man和β-Hex基因編輯效果進(jìn)行檢測,結(jié)果表明14株α-Man轉(zhuǎn)基因番茄植株有兩株檢測到突變現(xiàn)象,而β-Hex轉(zhuǎn)基因植株均未檢測到突變現(xiàn)象。α-Man突變體TA克隆測序結(jié)果顯示有兩種編輯類型,一種表現(xiàn)為52 bp的indel突變,導(dǎo)致α-Man基因序列發(fā)生移碼突變,功能喪失。另一種表現(xiàn)為單堿基突變,且均為A-G或C-T轉(zhuǎn)換,說明單靶點(diǎn)敲除載體編輯效率低。此外,雙靶點(diǎn)編輯載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化番茄成株也沒有檢測到突變現(xiàn)象,載體編輯效果有待進(jìn)一步驗(yàn)證。結(jié)論:本研究實(shí)現(xiàn)了對加工番茄α-Man酶基因的編輯,獲得了α-Man基因功能喪失的移碼突變體。
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TS255.1
【圖文】：

sgRNA表達(dá)框示意圖

植物表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2742072