發(fā)布時間：2020-07-04 05:47

【摘要】：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,簡稱“金葡菌”)是引起食源性疾病的常見病原菌之一,對食品安全及人類健康產(chǎn)生嚴重威脅。此外,金葡菌還可以引起感染,造成皮膚和軟組織損傷,甚至引起敗血癥、肺炎等。金葡菌能夠產(chǎn)生多種毒力因子是導(dǎo)致食源性疾病和感染的主要原因。金葡菌的真核樣絲氨酸/蘇氨酸磷酸酯酶(eukaryotic-like Ser/Thr phosphatases,Stp1)能夠調(diào)控多種毒力因子的分泌和表達,且可參與到許多重要的通路中,是金葡菌致病力發(fā)揮的重要蛋白分子。因此以Stp1作為抑菌劑的作用靶點來降低金葡菌的致病能力,是解決隨著抗生素濫用而產(chǎn)生的金葡菌耐藥性難題的可行策略。本論文構(gòu)建了PET-28a-Stp1原核表達質(zhì)粒,獲得了高純度的Stp1重組蛋白。篩選了多種靶向Stp1的天然抑菌劑,測定了連翹酯苷A、迷迭香酸、氯化矢車菊素對Stp1的半抑制濃度(IC_(50))。通過分子對接、分子動力學(xué)模擬、結(jié)合自由能計算及分解分析了Stp1與連翹酯苷A、迷迭香酸、氯化矢車菊素的作用機制。通過突變子分子動力學(xué)模擬、突變子結(jié)合自由能計算、定點突變試驗、磷酸酯酶活性試驗和熒光淬滅試驗驗證了三種天然抑菌劑與Stp1的作用機制。具體研究結(jié)果如下:(1)篩選了18種可直接與Stp1相互作用的天然抑菌劑,其中迷迭香酸、連翹酯苷A和氯化矢車菊素對Stp1抑制效果最明顯(2)連翹酯苷A對Stp1的IC_(50)為2.38μg/mL。連翹酯苷A是競爭性抑制劑,主要通過氫鍵和疏水相互作用結(jié)合在Stp1的活性區(qū)域,直接影響Stp1的活性,且結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基為Phe156、Thr157、Arg161、Tyr199、Asn229、His230、Lys232和Asp233。相比于野生型Stp1,連翹酯苷A與Stp1突變子F156A、R161A和D233A的結(jié)合區(qū)域和結(jié)合方式?jīng)]有發(fā)生改變,抑制作用降低,結(jié)合力下降,表明Phe156、Arg161和Asp233是連翹酯苷A與Stp1結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基,驗證了連翹酯苷A抑制Stp1活性的機制為競爭性抑制。(3)迷迭香酸對Stp1的IC_(50)為0.91μg/mL。迷迭香酸是競爭性抑制劑,主要通過氫鍵和疏水相互作用結(jié)合在Stp1的活性區(qū)域,直接影響Stp1的活性,且結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基為Arg14、Met39、Gly40、Lys43和Lys232。相比于野生型Stp1,迷迭香酸與Stp1突變子R14A、G40A和K232A的結(jié)合區(qū)域和結(jié)合方式?jīng)]有發(fā)生改變,抑制作用降低,結(jié)合力下降,表明Arg14、Gly40和Lys232是迷迭香酸與Stp1結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基,驗證了迷迭香酸抑制Stp1活性的機制為競爭性抑制。(4)氯化矢車菊素對Stp1的IC_(50)為14.59μg/mL。氯化矢車菊素是競爭性抑制劑,主要通過氫鍵和疏水相互作用結(jié)合在Stp1的活性區(qū)域,直接影響Stp1的活性,且結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基為Asp194、Asp198、Tyr199、Ala226、Asp228和His230。相比于野生型Stp1,氯化矢車菊素與Stp1突變子D198A和H230A的結(jié)合區(qū)域和結(jié)合方式?jīng)]有發(fā)生改變,抑制作用降低,結(jié)合力下降,表明Asp198和His230是氯化矢車菊素與Stp1結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基,驗證了氯化矢車菊素抑制Stp1活性的機制為競爭性抑制。本論文不僅篩選18種可直接與Stp1相互作用的天然抑菌劑,而且分析了迷迭香酸、連翹酯苷A、氯化矢車菊素抑制Stp1的機制,這將為以Stp1為靶點的天然抑菌劑開發(fā)和迷迭香酸、連翹酯苷A、氯化矢車菊素應(yīng)用于食品工業(yè)和制藥工業(yè)提供理論參考。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TS202.3
【圖文】：

論-Stp1 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建過以金葡菌 USA300 基因組為模板的 PCR 擴CR 擴增產(chǎn)物進行分析，結(jié)果如圖 2.1，stp1 基對 PCR 擴增產(chǎn)物和 PET-28a 進行雙酶切，將酶 重組質(zhì)粒。質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 DH5α，挑取單菌落接種 PCR 鑒定，鑒定結(jié)果如圖 2.2，陽性菌液可擴，陰性菌液未見有 PCR 產(chǎn)物。提取陽性菌液的切鑒定，鑒定結(jié)果如圖 2.3，用瓊脂糖凝膠電tp1 基因。將兩次鑒定結(jié)果均為陽性的質(zhì)粒測序比對后同源性為 100%的質(zhì)粒進行后續(xù)實驗。

圖 2.2 菌液 PCR 鑒定電泳圖1：空白載體菌落 PCR；2 和 3：重組載體菌落Fig 2.2Agarose gel electrophoresis of colony PCony PCR of blank vector; 2: Colony PCR of recom

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